HPLCELSD 法测定复方丹参滴丸中人参皂苷Rg1, Rb1 和三七皂苷R1 的含量[J]

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1、中药新药与临床药理. 2002, 13(3): 174-176HPLC-ELSD法测定复方丹参滴丸中人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的含量黄永焯，王宁生(广州中医药大学临床药理研究所，广州510405)关键词：复方丹参滴丸化学；人参皂苷分析；三七皂苷分析；色谱法，高压液相；蒸发光散射检测器摘要：目的: 建立复方分参滴丸中人参皂苷Rgl和Rb1，三七皂苷R1的含量测定方法。方法：应用高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)，采用固相萃取技术对样品进行预处理，Hypersil NH2柱，流动相为乙腈-异丙醇-10mmol/L醋酸铵水溶液 (冰醋酸调ph 5.0)(15:4:1)；流

2、速：0.6mLmin-1，测定了复方丹参滴丸中人参皂苷Rg1、Rb1，和三七皂苷R1的含量。结果：该方法测定人参皂苷Rg1、Rb1，和三七皂苷R1的线性范围为1.010.0g，其加样回收率为95.3100.4%，日内精密度2%、日间精密度4%。结论: 方法简便准确，可为三七制剂的含量测定方法提供借鉴。中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1003-9783(2002)03-0174-03 复方丹参滴丸由丹参、三七和冰片等三味中药，经科学方法提取有效成分精制而成，是治疗心血管疾病的常用药。其中三七Panax Notoginseng (Burk.) F. H. Chen是我国名贵的中

3、药材，其主要活性成分达玛烷系四环三萜类皂苷具有多种显著的药理作用，含三七的复方制剂常以其作为指标成分进行含量测定。 采用高效液相色谱蒸发光散射检测法对复方丹参滴丸中人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1进行了含量测定。在样品预处理中，采用固相萃取技术(SPE)直接对样品水溶液进行净化处理，并采用NH2柱，以乙腈-异丙醇-10mmol/L醋酸铵水溶液冰醋酸调PH 5,0(15:4:1)为流动相的RP-HPLC法，可取得满意的结果。1仪器与试药 Waters 515高效液相色谱仪，Alltech500蒸发光散射检测器，Waters Millennium32色谱工作站。安捷伦AccuBOND II O

4、DS SPE柱(500mg，6mL)。 人参皂苷Rg1和Rb1，三七皂苷R1对照品(中国药品生物制品检定所)，复方丹参滴丸(天津天士力公司)，乙腈（Merck色谱纯），异丙醇（Tedia色谱纯)，三蒸水，其他试剂均为广州化学试剂厂分析纯。2方法与结果2. 1 色谱及检测条件 色谱柱：大连伊利特Hypersil氨基柱（200 mm *4.0mm，5m）；流动相：乙腈-异丙醇-10mmol/L醋酸铵水溶液(冰醋酸调pH 5.0)(15:4:1)；流速0.6mLmin-1；柱温：室温；ELSD漂移管温度：55；氮气流量：2.3Lmin。 在上述色谱条件下，人参皂苷Rg1，和Rb1，三七皂苷R1三者可

5、达基线分离。2. 2 样品供试品溶液的制备精密称取复方丹参滴丸样品适量(约0.25g)、精确加入8mL三蒸水，超声处理10min过滤，取滤液。精确移取2mL加于已处理好的ODS固相萃取柱(10mL甲醇活化，5mL水平衡)，先用20%甲醇3mL淋洗，然后用40%和50%甲醇各3mL洗脱，一齐收集为A液；再用65%和70%甲醇各3mL洗脱，一齐收集为B液。于水浴60空气吹干。残渣精确加入流动相1mL溶解，过0.45m滤膜，取续滤液备用。A液供测定人参皂苷Rg1、三七皂苷R1；B液供测定人参皂苷Rb1。2. 3 线性关系 分别精密称取人参皂苷Rg1，和Rb1，三七皂苷R1对照品适量，用甲醇溶解配制成

6、0.2mgmL-1的溶液，取此溶液50，40，25，10，5L依次进样，按色谱测定条件，测得人参皂苷Rg1和Rb1，三七皂苷R1的峰面积，用最小二乘法以进样量(g)对数(lgX)对峰面积对数(1gY)进行线性回归，回归方程分别为： Rg1：1gY6.1986+1.2751 1gX (r20.9987) R1：1gY6.1690+1.27851 1gX (r20.9996) Rb1，：1gY6.0608+0.2254 lgX (r20.9998) 线性范围为1.010.0g。2. 4 样品测定 取样品供试品溶液在上述色谱条件下测定，结果见表1。表1 样品测定结果 （N=3）批号人参皂苷Rg1人参

7、皂苷Rb1三七皂苷R1含量/(mgg-1)RSD%含量/(mgg-1)RSD%含量/(mgg-1)RSD%9805132.24671.92.42940.41.05252.29910163.26560.83.56552.21.23701.90004313.02480.63.10510.81.25642.12. 5精密度试验日内精密度试验：取对照品溶液适量连续进样5次，测得各峰面积，计算RSD。日间精密度试验：取对照品溶液适量连续进样5d测得各峰面积，计算RSD。结果见表2。表2 HPLC-ELSD法测定人参皂苷Rg1和Rb1、三七皂苷R1的日内和日间精密度(N5)测定成份进样量/g日内精密度日间

8、精密度峰面积RSD%峰面积RSD%Rg111544552293461.91541019277381.85123985881983771.6122512523675383.08232516491860130.8233453243268351.4R111476906132920.91461088496773.4511410222216794218225091946031.9112140053588483.280.9220950254860912.2Rb122603480442591.72590508362671.458288650745980.980976761457581.81019466479

9、872990.45193191502704681.42. 6 加样回收率试验精密称取己知含量的样品适量，分高中低量加入一定量对照品，按供试品溶液制备项下操作，制备溶液，测定，计算。结果见表3。表3 加样回收率试验测定结果测定成分样品含量/mg对照品加入量/mg测得值/mg平均加样回收率/%RSD%Rg10.17870.260.427695.72.20.180.356798.93.50.90.268599.72.7R10.07420.120.192498.53.90.80.0878100.40.80.50.123297.92.7Rb10.18340.30.468995.32.10.20.3815

10、98.93.40.10.281998.52.92. 7 稳定性试验取同一样品供试品溶液，分别在0、2、4、6、8h进样测定，测定结果表明在8h内稳定，RSD2.1%。2. 8 重现性试验取同一样品(批号991016)，按供试品溶液制备项下操作，制备5份，按色谱条件测定含量。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量(mg/g)和RSD分别为3.2924(0.6%)，3.6630(1.7%)、1.1955(1.4%)(N5)。3 讨论3. 1 三七中所含的人参皂苷Rg1，和Rb1、三七皂苷R1均为四环三萜类皂苷，紫外吸收为末端吸收，与一些常用的有机溶剂的截止波长接近，影响测定。使用紫

11、外低波长检测，会给测定带来一定困难。ELSD为一新型通用检测器，其信号响应与被测物的质量成正比，而不依赖于被测物的光学特性及官能团，理论上可用于挥发性低于流动相的任何组分的检测。它对无紫外吸收或为紫外末端吸收的物质如糖类、皂苷类、甾类等有较好的响应。3. 2 曾对C18柱和NH2柱进行了研究，结果发现NH2柱在12min内即可将三者分离。C18柱需用梯度洗脱，才可在适当的分析时间内将其分离，而且对人参皂苷Rg1和三七皂苷R1的分离效果不甚理想。人参皂苷及三七皂苷是极性较强的化合物，氨基键合相为一种极性的固定相，对它们的分离效果优于C18柱；而且对人参皂苷Rg1，和三七皂苷R1可获得满意的分离度

12、。3. 3 复方丹参滴丸中多为水溶性成分1，而待测成分极性亦较大，如何除去其他成分对测定的干扰，是预处理中首要解决的问题。在含皂苷样品预处理中，多用正丁醇液液萃取2及大孔树脂柱层析纯化3, 4。曾对正丁醇萃取，中性氧化铝柱层析，大孔树脂柱层析分离及SPE技术对样品的预处理进行了考察。结果发现，采用SPE方法对样品进行预处理。除去干扰成分的效果较好，而且具有样品用量少、操作步骤简单、快捷等优点。3. 4 样品洗脱A液含人参皂苷Rg1和三七皂苷R1，样品洗脱B液含人参皂苷Rb1，由于样品洗脱B液中有一未知成分其色谱行为与三七皂苷R1相似，而且此成分在ODS萃取柱上的保留与洗脱条件与人参皂首Rb1一致，所以，为避免其影响R1的测定，未有将A、B两液合并，而是将其分别处理、测定。参考文献：1. 杨国祥复方丹参滴丸的临床应用c全国中药(复方丹参)现代化学术研讨会论文集19992. 吴广宣野山参与园参中皂甙含量的对比分析J药学通报；1988，23(7)：3973. 唐第光大孔树脂吸附法提取三七总苷工艺探讨J中成药；1990，(3)：54. 刘中秋，蔡雄大孔吸附树脂富集三七总皂苷工艺研究J中国实验方剂学杂志；200l，7(3)：4-6