发酵条件对红茶菌生长及菌液酸度影响的研究

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1、*(山东农业大学生命科学学院，山东 泰安271018)摘要：以糖茶水为发酵培养基，利用红茶菌发酵技术，对发酵过程中菌液中的酵母菌和醋酸菌进行计数，绘制其生长曲线，并对菌液酸度进行测定。结果表明：不同条件、不同发酵时期酵母菌和醋酸菌的数量不同，其菌液酸度也不同。 关键词：红茶菌；酵母菌；醋酸菌；酸度Effect of Fermentation Conditions on Growth of Tea Fungus and Acidity in Tea BrothWAN Chun-mei，CAI Ying-qi，WANG Xiao-ting，WANG Fang*,(College of Life S

2、cience, Shandong Agricultural University, Tai an271018, China)Abstract ：Tea infusion with sugar was used as the medium to conduct fermentation experiments with tea fungus. Acetic acidbacteria and yeast counts were determined during fermentation process to establish growth curves. Meanwhile, acidity

3、in tea infusion was also determined. Results indicated that acetic acid bacteria and yeast counts were different and acidity in tea infusion also exhibited a difference at different fermentation conditions.Key w ords：tea fung us；yeast cell；acetic acid b acteria；acid ity中图分类号：Q815文献标识码：A文章编号：1002-663

4、0(2010)01-0206-05红茶菌是用糖茶水加菌种发酵后生成的对人体有益的物质，是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的共生体 1 - 2 ，其 本身的酸度有效地抑制了有害细菌的生长，对人体健康 非常有益。对萎缩性胃炎，胃溃疡等疑难病症有很好 的治疗作用，除此之外，它还有提高人体免疫力，调 节血压，清理肠胃，帮助消化，提高大脑活力，消 除疲劳，振奋精神等功效 1 。本实验通过对不同的培养 基成分、不同形式的菌种和组成红茶菌的 3 种菌种( 酵 母菌、醋酸菌、乳酸菌) 对酵母菌、醋酸菌菌数和菌 液酸度的影响进行研究，以期为其发酵生产提供参考 依据。 红茶菌菌液和菌膜由山东农业大学微生物实验中心提供；用平

5、板划线分离法从已发酵好的红茶菌菌液中分 离出酵母菌、乳酸菌、醋酸菌菌种，用无菌水制成浓 度约为 10 6 个 /m L 的菌悬液。1.1.2培养基发酵培养基：茶、糖( 绵白糖) 、水按一定比例配制而成。配制方法：先将纯净水煮沸，煮沸后加入一定量的茶叶和绵白糖，再煮沸 5 m i n ，滤去茶叶，将 糖茶水分装于 2 5 0 m L 的锥形瓶中，冷却备用 3 -5 。分离计数培养基：酵母菌培养基( P D A ) 配比为： 马铃薯 2 0 0 g 、蔗糖 2 0 g 、琼脂 2 0 g 、水 1 0 0 0 m L 。醋 酸菌、乳酸菌培养基( 牛肉膏蛋白胨培养基) 配比为： 牛肉膏 3 g 、蛋

6、白胨 1 0 g 、N a C l 5 g 、琼脂 2 0 g 、水1000mL。1.2 仪器与设备ZDX-35BI 座式自动电热压力蒸汽灭菌器 上海申安 医疗器械厂；DNP-9162 电热恒温培养箱 上海精宏实验 设备有限公司；SW-CJ-IFD 超净工作台 苏州安泰空气 技术有限公司。1 材料与方法1.1 材料与试剂材料与菌种绵白糖( 食用级) ；红茶、绿茶、马铃薯1.1.1市购；纯净水( 饮用级) ；自来水；琼脂；N a O H ( 分析纯) 、蛋白胨 天津市凯通化学试剂有限公司；牛肉浸膏 天津市 英博生化试剂有限公司；蔗糖(分析纯) 上海国药集团化学试剂有限公司。收稿日期：2 00 9

7、 -0 4 -0 8作者简介：万春美( 1 9 8 5 ) ，女，本科生，研究方向为生物技术。E - m a i l ：w c m . 1 1 2 1 1 6 3 . c o m* 通信作者：王芳( 1 9 7 1 ) ，女，实验师，硕士，研究方向为微生物学分类。E - m a i l ：w f s d a u . e d u . c n2.50%，分别配成 200mL 培养基，分别接入 50mL 菌液和1.31.3.1方法不同茶叶量对发酵过程中酵母菌和醋酸菌数量及面积约 100cm2 、厚约 0.5cm 的菌膜，静置，32恒温箱中发酵 10d，其间每隔 24h 测一次菌种数量和酸度变化1.4

8、 发酵指标测定菌液酸度的影响固定发酵培养基中糖水比例为 2.50%(m/V)，采用不 同的茶水比例，分别为 0 . 0 5 % 、0 . 10 % 、0 . 1 5 % ( m / V ) ， 分别配成 200mL 培养基，接入 50mL 菌液，静置，32 恒温箱中发酵 1 0d ，其间每隔 2 4h 测一次菌种数量和酸 度变化。 菌数测定采用平板计数法2,6 ；酸度测定采用酸碱滴定法。 2 结果与分析不同茶叶量对发酵过程中酵母菌和醋酸菌数量及菌2.1不同糖的量对发酵过程中酵母菌和醋酸菌数量及1.3.2液酸度的影响菌液酸度的影响固定发酵培养基中茶水比例为 0.10%(m/V)，采用不 同的糖水

9、比例，分别为 1 . 2 5 % 、2 . 50 % 、5 . 0 0 % ( m / V ) ， 分别配成 200mL 培养基，接入 50mL 菌液，静置，32 恒温箱中发酵 1 0d ，其间每隔 2 4h 测一次菌种数量和酸 度变化。 0.05% 茶叶中酵母菌数0.10% 茶叶中酵母菌数0.05% 茶叶中醋酸菌数0.10% 茶叶中醋酸菌数2520151050茶叶中醋酸菌数1.3.3不同种类的茶叶对发酵过程中酵母菌和醋酸菌数量及菌液酸度的影响固定发酵培养基中茶水、糖水比例分别为 0 . 1 0 % 、2 . 5 0 % ，采用不同种类的茶叶( 红茶、绿茶) ，分别配成200mL 培养基，接入

10、 50mL 菌液，静置，32恒温箱中 发酵 1 0 d ，其间每隔 2 4 h 测一次菌种数量和酸度变化。12345时间 /d6789图 1加入不同量茶叶时酵母菌和醋酸菌数量的变化曲线Fig .1 Ch an g e cu rve s o f ac e ti c ac i d ba c te ri a a nd ye ast c ou nt sd urin g ferme n ta ti o n pro ce ss wi th a d di ng va ri o us a mou nt s o f te a1.3.4不同种类的水对发酵过程中酵母菌和醋酸菌数量35302520151050及菌液酸

11、度的影响固定发酵培养基中茶水、糖水比例分别为 0 . 1 0 % 、2 . 5 0 % ，采用不同种类的水( 纯净水、自来水) ，分别 配成 2 0 0 m L 培养基，接入 5 0 m L 菌液，静置，3 2 恒温箱中发酵 10d，其间每隔 24h 测一次菌种数量和酸度 变化。 0.10% 茶叶0.15% 茶叶123456789时间 /d加入不同量茶叶时菌液酸度的变化曲线加入少量红茶菌的组成菌( 酵母菌、醋酸菌、乳1.3.5图 2酸菌)对酵母菌和醋酸菌数量及菌液酸度的影响固定发酵培养基中茶水、糖水比例分别为 0 . 1 0 % 、2.50%，分别配成 200mL 培养基，接入 50mL 菌液

12、，在 其中分别加入 5 m L 制备好的酵母菌、乳酸菌、醋酸菌菌悬液，静置，3 2 恒温箱中发酵 1 0 d ，其间每隔 2 4 h测一次菌种数量和酸度变化。Fi g. 2 C ha nge c urv es of a ci dit y in in fu sio n durin g ferme nta ti onp ro ce ss wi th a dd i ng v ario u s amou n ts o f te a从图 1 可以看出，红茶菌中酵母菌和醋酸菌数量变化规律不同，从接种第 2 天开始，酵母菌数量急剧增加，而醋酸菌在第 5 、6 天酵母菌开始减少时才开始显著增加。加入茶叶增多，

13、同一时期的菌数增多。从图1.3.6发酵瓶中不同层次的菌液酸度情况固定发酵培养基中茶水、糖水比例分别为 0 . 1 0 % 、2 可以看出，菌液酸度呈现与之相反的变化趋势，茶浓度越大，同一时期菌液酸度越小。由此分析，茶叶中2. 50 %，分别配成 20 00 mL 培养基，接入 50 0m L 菌液，置于发酵瓶内，静置，3 2 恒温箱中发酵 1 0 d ，其间 每隔 24h 取距液面约 5、15 、25c m 的不同层次的菌液， 测不同层次菌液的酸度变化。含有菌体生长所需的营养物质，可能还含有促进其生长的微量元素和生长因子；此外，菌液酸度随茶叶量的增加而减小，可能是由于茶叶中的碱性物质中和了发酵

14、产生的醋酸。 加入不同形式的菌种对发酵过程中酵母菌和醋酸不同糖的量对发酵过程中酵母菌和醋酸菌数量及菌1.3.72.2酸度 /(mmol/L)菌数 /(106 个 /mL)0.05% 茶叶 0.15% 茶叶中酵母菌数0.15%析其原因，可能是糖的量多，使醋酸菌大量繁殖，将糖分解， 产生醋酸。 生长，在绿茶培养基中，红茶菌也能正常生长，但菌数较少使发酵产生的醋酸量较少，从而使酸度较低。3025201510501.25% 糖中酵母菌数2.50% 糖中酵母菌数1.25% 糖中醋酸菌数2.50% 糖中醋酸菌数2520151050中醋酸菌数1234567时间 /d89123456789图 6使用不同种类的

15、茶叶时菌液酸度的变化曲线时间 /d使用不同糖的量时酵母菌和醋酸菌数量的变化曲线Fi g. 6 C ha nge c urv es of a ci dit y in in fu sio n durin g ferme nta ti onproce ss usin g d iffere nt kind s o f t ea图 3Fig .3 Ch an g e cu rve s o f ac e ti c ac i d ba c te ri a a nd ye ast c ou nt sd urin g fe rme nt at io n p ro ce ss wi th a dd i ng v

16、ario u s amou nt s o f su ga r2.4不同种类的水对发酵过程中酵母菌和醋酸菌数量及35302520151050菌液酸度的影响自来水中酵母菌数纯净水中酵母菌数自来水中醋酸菌数纯净水中醋酸菌数16141210864201234567时间 /d89图 4使用不同糖的量时菌液酸度的变化曲线Fi g. 4 C ha nge c urv es of a ci dit y in in fu sio n durin g ferme nta ti onproc ess wi th a dd in g va ri ou s amou nt s of sug ar12345时间 /d67

17、89图 7使用不同种类的水时酵母菌和醋酸菌数量的变化曲线Fig .7 Ch an g e cu rve s o f ac e ti c ac i d ba c te ri a a nd ye ast c ou nt sdu ri ng ferme nta ti on pro ce ss using d iffere nt ki nd s o f wat er2.3不同种类的茶叶对发酵过程中酵母菌和醋酸菌数量及菌液酸度的影响2520151050绿茶中酵母菌数绿茶中醋酸菌数 红茶中醋酸菌数201816141210864201234567时间 /d8912345时间 /d6789图 8使用不同种类的

18、水时菌液酸度的变化曲线Fi g. 8 C ha nge c urv es of a ci dit y in in fu sio n durin g ferme nta ti onpro cess usin g differe nt ki nds o f wa ter图 5使用不同种类的茶叶时酵母菌和醋酸菌数量的变化曲线Fig .5 Ch an g e cu rve s o f ac e ti c ac i d ba c te ri a a nd ye ast c ou nt s du ri ng fe rmen ta tio n proce ss u si ng di ffere nt k i

19、n ds of t ea从图 7 和图 8 可以看出，自来水中各种菌的数量都要比纯净水中少，且酸度也比纯净水的低，从外观颜 色看，自来水发酵后的颜色也比纯净水的浅，分析其从图 5 可以看出，不同种类的茶叶所配制的发酵培养基，各种菌的生长趋势大体相同，但同一时期数量酸度 /(mmol/L)菌数 /(106 个 /mL)菌数 /(106 个 /mL)菌数 /(106 个 /mL)酸度 /(mmol/L)酸度 /(mmol/L)红茶中酵母菌数自来水 纯净水 1.25% 糖2.50% 糖5.00% 糖5.00% 糖中酵母菌数5.00% 糖 绿茶红茶原因可能是，自来水中存在某些离子或其他物质，抑制了红茶

20、菌的繁殖，导致菌数减少，发酵不完全，酸 度较低。 2.6发酵瓶中不同层次的菌液酸度情况25201510502.5加入少量红茶菌的组成菌( 酵母菌、醋酸菌、乳酸菌)对酵母菌和醋酸菌数量及菌液酸度的影响 上层201816141210对照 加酵母菌加乳酸菌 加醋酸菌中间下层12345时间 /d678986420图 12同一培养基不同层次培养液酸度变化曲线Fi g.12 Chan ge c urv es o f a cidi ty in d ifferen t la yers of in fusi ond u ri n g fe rme n t a ti o n p ro ce ss12345时间 /

21、d6789图 9加入少量红茶菌的组成菌时酵母菌数量的变化曲线由图 1 2 可以看出，同一培养液中不同层次酸度不Fig .9 C ha ng e cu rv es of y ea st c ou nt d urin g ferme nt at io n proc essu si n g c o mp o u n d t e a fu n g u s同，培养前几天上层溶液酸度较低，可能是大多数菌用来形成菌膜，而只有少数用来发酵，培养后期各层181614121086420溶液酸度趋向一致。对照 加酵母菌加乳酸菌加醋酸菌2.7加入不同形式的菌种对发酵过程中酵母菌和醋酸菌数量及菌液酸度的影响加菌液中酵母

22、菌数加菌膜中酵母菌数加菌液中醋酸菌数加菌膜中醋酸菌数201816141212345时间 /d6789图 10加入少量红茶菌的组成菌时醋酸菌数量的变化曲线Fig . 10 Ch a ng e c urv es of a c et i c ac i d b ac te ria du rin g fermen ta t io n p roc e ss u si ng c omp o u nd t e a fu ng u s1086420从图 9 和图 10 可以看出：加入少量酵母菌后酵母菌大量繁殖，数量急剧增加，但醋酸菌却受到抑制，大 量繁殖时间较晚，且总体数量较少；加入乳酸菌和醋酸菌，都使酵母菌的

23、繁殖受到抑制，数量较少，加入乳 酸菌的菌液中酵母菌不仅繁殖受到抑制而且大量繁殖时间也推迟。但加入乳酸菌和醋酸菌的发酵过程中，醋酸菌 的繁殖加快，数量较多。从图 1 1 可以看出，对酸度而 言，加入酵母菌和醋酸菌对发酵最后的酸度影响不是很大，但加入少量乳酸菌的菌液酸度明显增加，分析其原 因可能是乳酸菌发酵产生乳酸，使其酸度明显增加。12345时间 /d6789图 13加入不同形式的菌种时酵母菌和醋酸菌数量的变化曲线Fig .1 3 C h an ge cu rv e s of ac et ic ac id ba ct e ri a a nd y e ast c ou nt s d urin g

24、fe rme nt at io n p ro ce ss u si n g di fferen t t ea fun g us c ul tu re s302520151050加菌膜403530252015105012345时间 /d6789图 14加入不同形式的菌种时菌液酸度的变化曲线对照加酵母菌 加乳酸菌加醋酸菌Fi g. 14 Ch ang es cu rv es of a cid it y in in fusio n durin g ferme nta ti onproc ess usin g di fferent t ea fun gu s cu lt ures12345时间 /d6

25、789从图 1 3 可以看出，加入菌膜的红茶菌发酵中，酵菌数 /(106 个 /mL)酸度 /(mmol/L)菌数 /(106 个 /mL)菌数 /(106 个 /mL)酸度 /(mmol/L)酸度 /(mmol/L)加菌液此，要得到具有较好保健功能且酸甜可口、味道鲜美醋酸菌有关 7 - 9 ，因此，可以考虑在发酵过程中根据菌膜生成情况判断菌液酸度，也可以通过加入菌膜发酵来 增加菌液酸度。除此之外还可以考虑将菌膜制成营养食 品，但菌膜的营养功能及其对人体的影响还有待进一步 研究。 的红茶菌饮品，糖、茶、水要保持一定的比例，本实验得出的最佳比例为，糖:茶:水 =1g:25g:1000mL。发 酵

26、时间对菌液中的菌数和酸度均有一定的影响，因此可 以通过控制发酵时间而得到菌数和酸度不同的红茶菌饮 品。此外，发酵开始的一段时间里，培养瓶中不同层 次的菌液酸度不同，因此如要取此阶段的菌液，要注 意所取菌液的层次。由此推测，可以在工业生产中取 不同层次的菌液以满足不同口味人群的需要。加入红茶的培养基中各种菌的数量要比加入绿茶的 培养基中各种菌的数量多，且相同培养条件和培养时间 下，酸度也大于加入绿茶的菌液酸度，说明红茶比绿 茶更适合红茶菌的生长。绿茶虽然不如红茶适合红茶菌 生长，但红茶菌在绿茶中也能正常生长，且酸度较低， 外观较透明，因此可以考虑生产绿茶制作的红茶菌饮 品。此外，自来水不宜用于红

27、茶菌的生长，因此要生 产出较好的红茶菌饮品，最好使用纯净水。红茶菌是 酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的共生体，本实验在进行了 红茶菌中乳酸菌数量测定后发现，乳酸菌的数量相对较 少，因此没有对乳酸菌进行进一步的研究。在实验过 程中，发现醋酸菌在马铃薯培养基(P DA )上也能正常生参考文献 ：顾学华. 健康长寿饮料: 红茶菌M. 福州: 福建科学技术出版社, 1981.周帼萍. 醋酸菌筛选培养基的优化和优良醋酸菌分离的研究J. 中 国酿造, 2004(6): 18-19.方心芳. 海宝是什么J. 黄海, 1951, 12(5): 113-115.过慈妹, 方世辉. 不同茶类茶汤对红茶菌生长及品质的影响J

28、. 茶 业通报, 2007, 29(3): 129-131.段宝蓝. 健康之友: 红茶菌M. 北京: 科学普及出版社, 1981. 蒋立文, 刘德华, 廖卢燕, 等. 红茶菌发酵过程中主要化学成分变化 的研究J. 食品科学, 2007, 28(3): 238-241.蒋立文, 刘德华, 唐道方, 等. 不同条件对红茶菌发酵酸度和成膜影 响的初步研究J. 食品科学, 2006, 27(9): 96-99.LEE S P, BAEK J S, LEE I S. Factors affecting production of bacterial cellulose and acids in KombuchaJ. Food Science and Biotechnology,2002, 11(4): 327-331.SOH H S, LEE S P. Production of microbial cellulose and acids inKombuchaJ. Journal of Food Science and Nutrion, 2002, 7(1): 37-42.123456789