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1、形态学试验常用试剂配置方法4% 多聚甲醛多聚甲醛 4g，加蒸馏水 100ml，加热至 60，搅拌并加入1M NaOH 数滴，调 pH 至 7.0，滤纸过滤，现配现用。0.01MPBS 缓冲液氯化钠 (NaCl)8.50g磷酸氢二钠 (Na2423.58gHPO12H O)磷酸二氢钠 (NaH24 2O)0.39gPO 2H加双蒸水至1000ml1M NaOH 调整 pH 至 7.2-7.4，室温存放。一袋独立包装的 PBS（2000ml）加 2000ml 蒸馏水溶解。0.01mol/L 枸橼酸缓冲液柠檬酸0.2g柠檬酸三钠1.5g加双蒸水至500ml1M NaOH 调整 pH 至 6.0，现用
2、现配。铬矾明胶液铬矾0.5g明胶5g蒸馏水1000ml以 500-800ml 蒸馏水加温溶解明胶， 待其完全溶解后加入铬矾， 最后加蒸馏水至 1000ml。载玻片事先以酸、碱洗涤剂洗净，蒸馏水洗，烤干，包被时水温不超过 70。DAB 试剂的配制（以DAB 试剂盒为例）在 1.5mlEP 管内加入 1-1.5ml 蒸馏水，加入一滴试剂 A ，混合均匀，然后将试剂 B 和试剂 C 各一滴加入其中，再次混匀。此溶液必须现配现用，配好后避光保存， 30 分钟内使用，剩余的液体应弃去。石蜡切片的制备1. 组织块从固定液中取出，流水冲洗 1-2h2. 脱水： 70%酒精 80%酒精 95%酒精 95%酒精
3、无水酒精无水酒精，各级酒精浸泡 30min-1h。3. 透明：彻底脱水后的组织经苯苯，各浸泡 30mim-1h。4. 浸蜡：完全透明的组织放入 56-58石蜡中 2-3h。5. 包埋：被切面向下包埋于石蜡中，冷却后成蜡块。6. 切片：旋转式切片机将蜡块切成 5-10m薄片，贴在经铬矾明胶处理的载玻片上。7. 58-60烤片 2-4小时。冰冻切片的制备1. 组织块从固定液中取出或者是刚刚取材的新鲜标本放入20%的蔗糖溶液中直至标本沉底（大约需要12-20 小时）；2. 0.01MPBS 缓冲液冲洗， 5min；3. 放入冰冻切片机内进行冰冻固定4. 待组织快固定好后行连续冰冻切片，片厚 5-20
4、m，放入 -20冰箱内保存。免疫组织化学染色步骤1将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯 20min二甲苯 10min）、入水（ 100%酒精 5min100%酒精 3min95%酒精 2min80%酒精 1min70%酒精 1min），蒸馏水冲洗后， 0.01M PBS 冲洗， 5min3 次；2枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达 92-96，维持 10-15min，自然冷却至室温， 0.01M PBS 冲洗， 5min3 次；33%H2O2 溶液， 37， 20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS冲洗， 5min3 次；4正常羊血清封闭， 37， 30 min；5倾去多余
5、血清， 滴加一抗，372 小时或者 4过夜，0.01M PBS 冲洗，5min3次；6滴加二抗工作液， 37， 30 min， 0.01M PBS 冲洗， 5min3 次；7滴加三抗工作液， 37， 30 min， 0.01M PBS 冲洗， 5min3 次；8DAB 避光显色，显微镜下控制显色时间；90.01M PBS 终止显色；10梯度酒精脱水（ 70%酒精 1min80%酒精 1min95%酒精 1min 95%酒精 1min无水酒精 10min无水酒精 10min），二甲苯透明（二甲苯 15min二甲苯 10min；11中性树胶封片。免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原
6、微波修复，温度92 -96， 10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭， 37， 60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，372 小时或者 4过夜， PBS 冲洗， 5min3 次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37， 60 min，0.01M PBS 冲洗， 5min3 次；(6)防淬灭封片剂封片， 4，避光保存。(7)荧光显微镜观察拍照。细胞免疫组化染色（培养板中染色）1培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS 洗两次，首先用4%多聚甲醛（ 4 孔板200l）固定 10min，PBS 洗 2 次，每次 510 分钟。2在含 0.1% Triton X-100（ 4 孔板 2
7、00l）的 PBS 中进行 10min 的透膜处理， PBS洗 2 次，每次 5-10 分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3羊血清用 PBS 配制成 4羊血清封闭液，室温封闭（4 孔板 200l）30 分钟。4吸尽液体， 勿洗，添加一抗，于 37条件下孵育 1h 或放在 4冰箱过夜， PBS洗 3 次，每次 5-10 分钟。5去除一抗后，细胞用PBS 洗三次。6加入二抗，然后加入相对应的孔，在37下作用 30-60min。PBS 洗 3 次，每次 5-10 分钟。7吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用30-60min。PBS 洗 3 次，每次 5-10分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三
8、抗的细胞作为阴性对照组。8DAB 避光显色，显微镜下控制显色时间；9PBS 终止显色；显微镜下观察拍照。细胞免疫荧光染色（培养板中染色）1培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS 洗两次，首先用4%多聚甲醛（ 4 孔板200l）固定 10min，PBS 洗 2 次，每次 510 分钟。2在含 0.1% Triton X-100（ 4 孔板 200l）的 PBS 中进行 10min 的透膜处理， PBS洗 2 次，每次 5-10 分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3羊血清用 PBS 配制成 4羊血清封闭液，室温封闭（4 孔板 200l）30 分钟。4吸尽液体， 勿洗，添加一抗，于 37条件下孵育 1h
9、 或放在 4冰箱过夜， PBS洗 3 次，每次 5-10 分钟。5去除一抗后，细胞用PBS 洗三次。6滴加荧光素标记的二抗，避光，37，60 min，0.01M PBS 冲洗， 5min3 次；7防淬灭封片剂封片， 4，避光保存。8荧光显微镜观察拍照。细胞爬片后的步骤同切片的免疫组织化学及免疫荧光的步骤。HE 染色1. 石蜡切片常规脱蜡入水：二甲苯、各15min100%酒精、 95%酒精、 80%酒精 70%酒精 50%酒精各 1-2min。2水洗：普通水洗2 次，蒸馏水洗 1 次。3. 苏木素染色 10min。4. 充分水洗：自来水洗 10min。5. 盐酸酒精分色：分色 10-30s，随时镜检分色程度，使不该着色的部分全部褪去，应着色的部分着色适当。着色标准：胞核为深蓝色，胞质无色或浅灰色。6. 充分水洗：自来水洗 10min。7. 氨水蓝化 2-3min。8. 充分水洗：自来水洗 10-15min，水洗后若染色太浅则可重新返回苏木素。9. 脱水： 70%、 80%酒精各 1-2min。10. 伊红染色 0.5min 左右，随时镜下观察，染色不宜过深，要与苏木素作对比，要协调鲜明。11 脱水透明： 95%酒精、各1-2min 100%酒精、各 15min二甲苯、各 15min。12中性树胶封片。
形态学试验常用试剂配置方法
