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1、实验二,常用实验动物小白鼠采血 RBC、WBC计数,实验目的,1、了解并熟悉小白鼠的采血方法； 2、掌握小白鼠眼眶后静脉丛采血。 3、学习微量采血法和血细胞计数法。,实验原理,用加有抗凝剂的溶液将定量的血液稀释，滴入血细胞计数室内，于显微镜下计数，求出一定容积的稀释血液中的RBC或WBC数，再将其换算成1L血液中的RBC或WBC个数。,实验用品,乙醚、二甲苯棉球、常用手术器械、注射器、玻璃取血管、培养皿、血细胞计数板、计数器、显微镜、微量吸血管、酒精棉球、消毒脱脂棉球、RBC稀释液、WBC稀释液。,RBC稀释液：0.9%NaCl溶液 NaCl（维持渗透压）0.5g， Na2SO4（使溶液比重增
2、加，RBC均匀分布不易下 沉）2.5g， HgCl2（固定RBC并防腐）0.25g，蒸馏水加至100ml。 WBC稀释液：冰醋酸1ml（破坏RBC），1%龙胆紫1ml（染白细胞核，便于计数），加蒸馏水至100ml。 小鼠RBC正常范围：7.7-12.51012个/L(150210个/格) 小鼠WBC正常范围：4.0-12.0109个/L (1030个/格),小白鼠采血,1、剪尾采血 需血量少时可用此方法。 将动物固定,显露尾部,将尾尖剪去约5mm，从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。 若用二甲苯棉球涂擦尾部或事先将鼠尾浸在45水中数分钟，使尾部血管充盈，可采到较多的血，但注意二甲苯可致溶血。
3、也可用锋利刀片割破尾动脉或尾静脉，让血液自行流出，采血后，消毒，止血。如将动物麻醉取血量可更多些。小鼠每次采血约0.1ml，大鼠约0.4ml。为了多次反复取血应尽量从鼠尾末端开始。,2、摘眼球采血: 此法常用于鼠类大量采血。 用左手固定动物，压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用无钩弯镊子或弯止血钳迅速摘除眼球，立即将鼠倒置，头朝下，眼眶内很快流出血液。 一般只适用于一次采血。大部分动物采血后可以存活，可采另一侧眼球取血。,3、心脏采血 将动物麻醉，使其仰位固定，剪去胸前区毛，消毒皮肤，在左侧第34肋间选择心博最强处穿刺，血液借心脏跳动的力量进入注射器。亦可在动物麻醉后，切开动物胸腔，直视心脏内抽血
4、或剪破心脏，直接用注射器、吸管等吸血。,4、眼眶后静脉丛采血 采血时，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。右手持一次性采血针，将其一端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入，小鼠刺入约23mm，大鼠刺入约45mm，当感到有阻力时即停止刺入，旋转微量吸血管以切开静脉丛，血液即流入取血管中，采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期内可重复采血。小鼠一次可采血0.20.3ml，大鼠一次可采0.51.0ml。,5、颈静脉或颈动脉采血 将鼠麻醉，剪去一侧颈部外侧被毛，作颈静脉或颈动脉分离手术，用
5、注射器即可抽出所需血量。也可插入导管，反复采血。 6、断头采血 操作者左手拇指和食指握住鼠颈部，头朝下，用利剪在头颈间1/2处迅速剪动物头部，提起动物，血液即可流入准备好的容器中。,RBC、WBC计数方法与步骤,1、熟悉血细胞计数板和微量吸血管的构造,1,1,1,2、微量采血和稀释 先准确吸取3.98ml RBC稀释液于一洁净试管内。 手持微量吸血管，将其管口浸入血滴，缓缓吸入血液至20l处，如吸入血液稍过量，可用手指或干棉球轻触管口，缓缓转动，可使血液吸出，至恰好与刻度相符。用干棉球将管口外面的血液擦拭干净。将血液加入到准备好的RBC稀释液中。 注意：应将采血管垂直插入稀释液底部，缓缓挤出血
6、液使之不扩散，轻吸上清液再挤出，使血液完全转入到试管中。 将血液和稀释液混匀。,3、充液 取洁净计数板及盖玻片，将盖玻片平放在计数板的计数室上。用干净吸血管或小吸管吸少量混匀的RBC稀释液，然后将管口斜置于盖玻片边缘的计数板毛玻璃斜面上，挤出少量稀释液，此时液体即由于毛细管作用而进入计数室内。但须注意，如果计数室内留有气泡或稀释液过多以致溢出室外的凹沟中，都应该洗去，再重新充液。,4、计数 充液后应让计数板静置8min，待RBC充分下沉后方可进行计数。先在低倍显微镜下观察分布是否均匀，如果分布很不均匀，应洗去重做。 在低倍镜下找到中央大方格，看清其横、竖线后即可用高倍镜来计数。显微镜的光圈应缩
7、小并降低聚光器使得视野较暗，这样RBC的轮廓可更清楚些。,通常选择中央大方格四角的4个中格和中央的1个中格来计数。计数为了防止遗漏，应按一定的顺序：即第一行先从左向右数到最后一格，下一行则从右向左数，以此类推。对于分布在双线上的RBC，则可计数左侧和上方线上的RBC，即按照“数上不数下，数左不数右”的原则。 计数时应将每个中格的RBC数记录下来，若发现各中格之间的RBC数相差超过15个时，表示其分布不均匀，应将计数室洗净，重新摇匀吸管中的稀释血液，再充液进行计数。,5、计算 RBC的稀释倍数为200倍：（0.02ml+3.98ml）/0.02ml=200 计数室5个中格的总容积： 0.2mm*
8、0.2mm*0.1mm*5=0.02mm3 设5个中格RBC总数为X，则1mm3稀释液RBC总数为X*50个。 1mm3血液中实际RBC数目：X*50*200个，即X*104，再乘以106得出1m3血液中的RBC数X*1010。,WBC基本与RBC相同，不同之处,1、吸取WBC稀释液为0.38ml，血液稀释了20倍。 2、在计数WBC时，计数4角的4个大方格中的WBC总数。其总容积为0.4mm3,换算成每升血液中的WBC数时，4个大方格内WBC数*2.5*20*106=WBC数/L。 3、计数时，如发现大方格之间的WBC数相差超过10个时，表示WBC分布不均匀，应重新充液计数。,思考题,1、在操作过程中，哪些因素可能影响计数的准确性？ 2、在采血过程中，应注意哪些方面？,
常用实验动物的采血小白鼠的红白细胞记数.ppt
