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1、Western blot、蛋白质双眉 原理.方法及在医学中的应月湘雅医学院精神医学1301Western blo蛋白质印迹法Western blottingGeorge Stark对电 泳后的蛋白质分子 行印迹分析从而发 western印迹技术Edward M. Southern建立 了将DNA转移到硝酸纤维 素膜（NC膜）上，并利 用DNARNA杂交检测特定 的DNA片段的方法1975 = 1979 同年二McMaster和Carmi chaeI 对RNA进行印迹分析，发什么是蛋白质印迹法？Westernblot法是凝胶电泳技术、固， 子亲和技术三者融为一体的综合性技术于把凝胶已分离的区带并
2、E卩迹于固化纟H电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。W(结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定笊不同的彳 查蛋白力研究一些体外的蛋白质分子，寻Western Blot的基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽”种固相支持体,然后用这种多肽的特异芳SubmieDelectable ProdvclProtein Riot on Z 讥.rx:ellL.a.bel with Specific AntibodyWestern Blotting 操作流程蛋白样品的制备ISDS聚丙烯酰胺凝胶电泳I转膜封闭I一抗孵育Western Blotting 操作流程第三步第一步抗杂交转膜Western Blotting 方法一
3、:直接法 1 快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带A.缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大. n 4亠 AJr亠二己-1 匹口曰电 /zfcWestern Blotting 方法二：间接法优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） 3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker缺点：B. 1.交叉反应引起的非特异性条带为什么_般情况下都采用间接法进行检直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标 不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需 抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强 情况下都采用间接法进行检测Western Bl
4、otting间接法操作流程SuperSignal底物与二抗HRP,AP反应,显色或发光一抗与蛋白结合（小鼠单抗 或兔多抗）HRP.AF白复合申Western Blotting 设计木不可小看“蛋白标准”一分子量标准预染分子修饰分子预混分子量标准高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准预染分子量标准单色预染多色预染修饰分子量标准糖基化预混分子量标准kDa500290240LMWHMW-SDSHMW-Native16097.0-66.0-45.0-220170-116-7匚669-11697高分子量标准低分子量标准宽分子量标准预染分子量标准单色预染多色预染修饰分子量标准糖基化磷酸化荧光标记Colo
5、r on WesternJhcoy lared 400- ug/cm2-卩125-20（存在下二材料质地P干的NC膜易脆7软而结实r机械强虞溶剂耐受性0无2无匸有卩操作程序7缓冲液润湿，避免气泡缓冲液润湿亠使用前1检测方式7常规染色，可用放射性和非放射性检测7不能用阴离子染料7常规染色 托考马斯 ECL检测 低滨序小令壬l-l【口J,单克隆抗体抗体的选择作为western来讲,理论上单抗比多抗的特开性要好, 般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于wester】ELIsh的抗体，一般来说甬于western的抗体识别的是 rrirr 有些是识另,有些是识别构像特异性。所以般根据抗体说明书:做免疫
6、印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所: 凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗 反应条带。觉得单抗和多抗价格上差弄与其处理方式有很大关系，可以仔细咨询一下化学显色法方便、便宜、灵敏 度较低、费抗体、 反应慢、线性窄、 不易保存、不能重 新剥离检测显色的甸 、一JF亲疋 彳灵体无重TypColori n方法RadiooChemil多克隆抗体蛋白质双向电:W K W n Enter your subtitle here双向电泳的实验原理第一向：等电聚焦第二向：SDS-PAGE 电第一向：等电聚焦57PH10100PHffo nunH 3BniinH 7.5第二向：SDSPAGE电泳聚丙
7、烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联 酰胺(Bis)在加速剂N,N,N，四甲基乙二甘 化剂硫酸鞍(AP)或核黄素的作用下聚合3 的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGpH 7.5Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their sizeSmallest proteins travel the furthest distance蛋白质双向电Enter your subtitle here技术流程提出实验组和对照组样品制备生物学问题一-双向电泳(2DE/DIGE)凝胶图像差界萤白点选取蛋1酶解及质谱分析双向电泳(2
8、DE/DIGE)目前进行蛋白质组学分析的最常麹能实现多达10000种不同蛋白质进彳双向电泳(2DE )示意图分子量大小等电聚焦，实现蛋白质按等电点/二 / kSC分2DE图谱硝酸银染色图谱考马斯亮蓝染f双向电泳（DIGE ）示意图DIGE图谱双向电泳的最关键步骤之一*制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质, 的操作步骤，注意防止样品提取过程中f 饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物丿变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分 中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其歩 硫尿。表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水. 至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表尬 污剂SDS、非离子去污剂Tr
9、iton X-100和NP40.两* CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用: 性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自P 疏基乙醇，以及不带电荷的三丁基麟(TBP)进行起载体作用的两性电解质：即便在变性剂 存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐国 才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋甘 点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中i 咎而保证蛋白质的溶解性。应用时，两也 度应小于0.2 % ( w/v)o浓度过高会使lEFf 另外，为了保证实验的精确性，在选择刁 IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与等电
10、聚焦通过10000V高压使得蛋白质按照其等电丿 焦步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、 聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平习 过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性玄 纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要彳 类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度于蛋白检测理想显色剂的7S安全(safety)灵敏(sensitivity)简单(simplicity)特异性(specificity) 快速(speed)稳定(stability) 兼容c( synergy)蛋白检测硝酸银染色优点：灵敏度高,质谱兼容性低质谱兼容性高质谱兼容性高、灵敏度高缺点：重复性差, 考马斯亮兰染色：优点：重复性好,缺点：灵敏度低荧光染色：优点：重复性好,图像分析常用软件：Image-Master (GE HealthcarePDque s t (Bio-Rad)分析步骤:胶点检测和定量、凝胶匹配、凝胶的图像处理分析和典型流程凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：/t tt V Z. -厶 一 * .-亠一-r* = y - - 一 一 - -厂应用丿I t Western blot及蛋白质双Western Blot的三大医学Westei1. Western blot法诊断囊虫疽礬蜃蠶霍绦虫幼虫即囊尾蝴寄生二含有猪肉绦虫幼虫的猪肉幼虫在人体小肠 内发育成成虫
Westernblot蛋白质双向电泳的原理方
