肿瘤的探讨

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1、【关键词】 肿瘤干细胞；肿瘤；分离纯化；多药耐药如何解决恶性肿瘤的复发和转移问题仍是当前肿瘤治疗中的一大难题。一种新的理论肿瘤干细胞学说认为，在肿瘤组织中存在着少数具有干细胞性质的细胞群体，这些细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，被称为肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)；CSCs可能是导致恶性肿瘤复发和转移的根本原因。本文就CSCs分离纯化和鉴定的方法和多药耐药机制的研究进展情况进行综述。1 CSCs理论的提出 肿瘤研究的传统理论认为肿瘤的发生、发展是全部肿瘤细胞共同增殖的结果，所有的肿瘤细胞都具有无限增殖的潜能。但随后在白血病的研究中发现1，2，仅有约1%的白血病细胞

2、可以在体外克隆增殖；在异种移植实验中，仅有1%4%的白血病细胞可以在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠脾脏内形成肿瘤。1977年，Hamburger等3在肺癌、卵巢癌和神经细胞瘤等实体瘤的研究中也发现了相同的现象，并首次明确提出了“肿瘤干细胞假说”，认为肿瘤起源于少数具有自我更新能力和多向分化潜能的CSCs。 1997年Bonnet等4首次从人类急性髓性白血病( acute myeloid leukemia，AML )中分离出了表型为CD34+CD38的白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)，第一次证实了CSCs的存在。研究发现，接种CD34+CD

3、38细胞到NOD/SCID小鼠体内即可形成肿瘤，而CD34CD38+细胞则不能形成肿瘤。 2003年，AlHajj等5从乳腺癌组织中分离出表型为CD44+CD24/lowLineage的乳腺癌细胞，这是首次在实体瘤中发现了CSCs的存在。迄今为止，已经在脑肿瘤、肺腺癌、前列腺癌和结肠癌等69多种肿瘤中发现了CSCs，进一步证实了CSCs理论。2 CSCs的生物学特性 CSCs具有很多与正常成体干细胞相似的特性，但又存在着不同之处。CSCs的生物学特性主要表现在以下方面：具有自我更新能力，能够在体内外无限分裂增殖；多向分化潜能，CSCs能够产生不同分化类型的子代细胞；多处于细胞生长周期的G0期，

4、长期保持休眠状态，因此常规化疗药物无法杀死数量极少且增殖不活跃的CSCs；抗凋亡，CSCs高度表达抗凋亡基因Bcl2；具有端粒酶活性；其生长发育受Wnt通路、Notch通路和Shh通路等多条信号转导通路调控；耐药性，CSCs膜表面表达多种ABC转运蛋白(ATPbinding cassette transporter)，可以利用ATP水解提供的能量把药物泵出细胞外，使细胞免受药物的伤害10，11。3 CSCs的分离纯化和鉴定 CSCs的分离纯化和鉴定是CSCs研究的前提和基础。但由于CSCs在肿瘤组织中所占的比例很小，而且目前从形态学上很难区分CSCs和肿瘤细胞，所以现在仍有很多CSCs没有被分

5、离出来。目前CSCs的分离纯化方法主要有以下三种：3.1 CSCs特异性表面标记法 根据CSCs表面标记（膜蛋白、黏附分子及受体等）与一般肿瘤细胞的差异，采用正常干细胞/祖细胞的标记物或与肿瘤的发展转移有关的标记物，通过流式细胞仪分选法(fluorescence activated cell sorting，FACS)和免疫磁珠分选法(magnetic activated cell sorting，MACS)分选CSCs。 FACS是利用CSCs和肿瘤细胞结合荧光素标记抗体能力的差异进行分选，特异性和敏感性强，是目前应用最广泛的CSCs分离技术。Dalerba等12将人结肠癌组织解离为单细胞悬

6、液，采用CD44和上皮细胞黏附分子EpCAM做标记，利用FACS成功分选出了表型为EpCAMhighCD44+的结肠癌干细胞。 MACS是利用CSCs表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗结合而进行分选。该方法对细胞损伤小，不会影响细胞的功能和活力，而且成本较低，是目前国内应用较为广泛的CSCs分离技术。Yuan等13利用此方法成功从人脑胶质瘤中分离出了CD133+的胶质瘤干细胞。3.2 Hoechst 33342染料法Hoechst 33342染料法是利用CSCs的侧群干细胞（SP细胞）特性来分选CSCs的方法。SP细胞是Goodell等14用DNA染料Hoechst33342分选鼠造血干细胞时

7、发现的一群染色偏低的细胞群体。SP细胞表面高表达ABC转运蛋白，能将染料Hoechst 33342排出体外而在流式细胞检测中表现为不着色。实验发现，SP细胞不但具有自我更新能力和多向分化潜能等干细胞的一般特性，还具有比非SP细胞更强的侵袭性及活体成瘤能力，提示其中可能含有大量的CSCs。目前已经从胶质瘤15、肺癌16、乳腺癌17等多种肿瘤组织中分离出了SP细胞。3.3 悬浮培养法悬浮培养法是利用CSCs在无血清培养液中能悬浮生长形成肿瘤干细胞球的特性来分选CSCs的方法。Singh等18将用此方法得到了表型为CD133+的脑肿瘤干细胞克隆形成的神经球样集落，Ponti等19在无血清培养基中得到

8、了表型为CD44+CD24Cx43的乳腺癌干细胞球。3.4 CSCs的鉴定CSCs的鉴定主要依据CSCs的自我更新能力、多向分化潜能和致瘤能力这三大特性来进行，包括体外实验和体内实验两个方面20。体外实验通常采用经典的软琼脂克隆形成实验，CSCs在软琼脂培养基上能形成克隆，而肿瘤细胞则不能形成克隆。体内实验采用动物成瘤性实验，接种CSCs到NOD/SCID小鼠体内能形成肿瘤，而接种肿瘤细胞则不能形成肿瘤。4 CSCs与肿瘤耐药 恶性肿瘤的治疗方法主要有手术、化疗和放疗三种，化疗在恶性肿瘤的治疗中发挥着重要的作用。导致化疗失败的主要原因是肿瘤多药耐药性(multidrug resistance，

9、MDR)的产生即肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制完全不同的其他化疗药物也产生交叉耐药。 CSCs理论认为CSCs参与了肿瘤的多药耐药21。常规化疗药物只能杀死肿瘤细胞，却无法杀死CSCs，因而导致化疗失败，肿瘤复发、转移。CSCs的MDR机制主要有以下三方面：4.1 高表达ABC转运蛋白ABC转运蛋白是一类跨膜蛋白，其功能域由6个疏水性氨基酸组成的跨膜结构和1个ATP结合域构成。ABC转运蛋白可通过ATP水解释放的能量将糖、蛋白质、毒素和药物等多种物质转运到细胞外。CSCs表面高表达ABC转运蛋白，可以将化疗药物逆浓度梯度由细胞内转移到细胞外，从而避免了化疗药物对肿瘤干

10、细胞的杀伤作用。这是导致肿瘤MDR产生的主要原因。 目前发现的与CSCs耐药有关的ABC转运蛋白主要有P糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白(MRP)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)。现已证实，Pgp高表达是产生MDR的主要机制，并且在白血病、结肠癌、肝癌等多种肿瘤组织中均发现了Pgp呈阳性表达，Pgp表达水平的高低还揭示了肿瘤的愈后及复发的可能性22，23。4.2 处于细胞生长周期的G0期CSCs多处于细胞生长周期的G0期，增殖不活跃，对临床上常用的周期时相特异性化疗药物不敏感24。这些药物只能杀死处于有丝分裂期增殖活跃的肿瘤细胞，而对CSCs的杀伤作用并不大。停药后CSCs一旦受到适当刺激便可重

11、新进入细胞分裂周期，继续分裂增殖生成新的肿瘤细胞，造成肿瘤复发。4.3 抑制凋亡CSCs高度表达Bc12基因家族的bcl2，bclx和bclw等抗凋亡基因，使得通过诱导肿瘤细胞凋亡达到治疗目的的化疗药物无法发挥作用，导致肿瘤耐药性的产生。核转录因子(NF)B、突变的p53基因及cmyc基因等也通过上调抗凋亡基因的表达等多种途径抑制了CSCs的凋亡25。5 CSCs研究的意义及展望 CSCs理论的提出是肿瘤研究中的重大突破，使科学家对肿瘤的发生发展过程有了一个新的认识，为肿瘤发病机制的研究提供了新思路。目前已经从多种肿瘤组织中分离鉴定出了CSCs，对CSCs生物学特性和耐药机制的研究也有助于肿瘤

12、诊断、治疗方法的改进和创新。 当前针对CSCs产生了许多新的肿瘤治疗方法26，如针对CSCs表面分子的靶向治疗，采用ABC转运蛋白抑制剂抑制ABC转运蛋白的活性，采用促进CSCs分化的药物促进CSCs分化等。这些治疗方法虽然已经取得一定进展，但还有待于进一步的完善。 虽然目前有越来越多的证据支持CSCs理论，但CSCs的研究中仍然存在着许多问题27。首先，并不是所有肿瘤中都分离到了CSCs；其次，CSCs分离和鉴定的技术仍不完善；再次，还没有确定的CSCs特异性表面标志；最后，对CSCs调控机制的研究还不够深入。只有解决了这些问题，才有可能真正攻克肿瘤这个医学难题。【参考文献】 1 Bruce

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