研究进程计划表-殷晓霞

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1、江 南 大 学研究生论文工作进程计划表学科或专业 发酵工程 研究方向 发酵工学 研究生姓名 殷晓霞 学位级别 硕士 导师姓名 陈坚 填表日期 2011 年 6 月 19 日注：此表为研究生在导师或指导小组的指导下，由研究生本人填写，经导师、中心主任、研究生所在专业的责任教授审阅后，报研究生部备案，非经同意不得改动。论文题目代谢工程改造解脂亚洛酵母产a-酮戊二酸本人已查阅过哪些科研资料及调研情况：a-酮戊二酸(a-ketoglutarate，a-KG)，又称a-胶酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸。a-酮戊二酸在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，是三羧酸循环(TCA)的重要中间产物之一，在生物

2、体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢。a-酮戊二酸在食品、医药、有机合成、化妆品和饲料等工业中都有着广泛应用。目前工业上生产a-KG主要采用化学合成的方法，但是低产量和大量使用有毒有害的化学试剂限制了它的发展空间。而微生物发酵法正以其独特的优势：高产量、低能耗、可持续发展等受到越来越多的关注。附下面一些重要的文献。1.Zhou JW, Zhou HY, Du GC, Liu LM, Chen JA. Screening of a thiamine-auxotrophic yeast for a-ketoglutaric acid overproduction. Lett. Appl

3、. Microbiol., 2010. 51(3): 264-271.2.Barth G, Gaillardin C. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiol. Rev., 1997. 19(4): 219-237.3.Lockwood LB, Stodola FH. Preliminary studies on the production of -ketoglutaric acid by Pseudomonas fluorescens. J. Biol. Chem

4、., 1946. 164(1): 81-83.4.Finogenova Tv, Losinov Ab, Belikov Vm, Ermakova It, Muntjan Ln, En S. Keto-acid production by paraffin-oxidizing yeasts. Mikrobiologiya, 1968.5.Chernyavskaya OG, Shishkanova NV, Finogenova TV. Biosynthesis of a-ketoglutaric acid from ethanol by yeasts. Appl. Biochem. Microbi

5、ol., 1997. 33(3): 261-265.6.Tsugawa R, Okumura S. Fermentation of N-paraffins by yeast. 2. Alpha-ketoglutarate productivity of Candida lipolytica in various culture media. Agri. Biol. Chem., 1969. 33(5): 676-&.7.Chernyavskaya OG, Shishkanova NV, Ilchenko AP, Finogenova TV. Synthesis of a-ketoglutari

6、c acid by Yarrowia lipolytica yeast grown on ethanol. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000. 53(2): 152-158.8.Liu LM, Li Y, Zhu Y, Du GC, Chen J. Redistribution of carbon flux in Torulopsis glabrata by altering vitamin and calcium level. Metab. Eng., 2007. 9(1): 21-29.9.Zhang DD, Liang N, Shi ZP, Liu L

7、M, Chen J, Du GC. Enhancement of -ketoglutarate production in Torulopsis glabrata: Redistribution of carbon flux from pyruvate to -ketoglutarate. Biotechnol. Bioproc. Eng., 2009. 14(2): 134-139.10.Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventi

8、onal yeast Yarrowia lipolytica: a review. J. Biotechnol., 2004. 109(1-2): 63-81.11.Roth R, Moodley V, Van Zyl P. Heterologous expression and optimized production of an Aspergillus aculeatus endo-1,4-beta-mannanase in Yarrowia lipolytica. Mol. Biotechnol., 2009. 43(2): 112-120.12.Neuveglise C, Nicaud

9、 JM, Ross-Macdonald P, Gaillardin C. A shuttle mutagenesis system for tagging genes in the yeast Yarrowia lipolytica. Gene, 1998. 213(1-2): 37-46.13.Fickers P, Le Dall MT, Gaillardin C, Thonart P, Nicaud JM. New disruption cassettes for rapid gene disruption and marker rescue in the yeast Yarrowia l

10、ipolytica. J. Microbiol. Meth., 2003. 55(3): 727-737.14.Forster A, Aurich A, Mauersberger S, Barth G. Citric acid production from sucrose using a recombinant strain of the yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2007. 75(6): 1409-1417.15.Poza M, Sestelo ABF, Ageitos JM, Vallejo JA,

11、Veiga-Crespo P, Villa TG. Cloning and expression of the XPR2 gene from Yarrowia lipolytica in Pichia pastoris. J. Agric. Food Chem., 2007. 55(10): 3944-3948.16.Holz M, Forster A, Mauersberger S, Barth G. Aconitase overexpression changes the product ratio of citric acid production by Yarrowia lipolyt

12、ica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2009. 81(6): 1087-1096.17.Zelle RM, De Hulster E, Van Winden WA, De Waard P, Dijkema C, Winkler AA, Geertman JMA, Van Dijken JP, Pronk JT, Van Maris AJA. Malic acid production by Saccharomyces cerevisiae: Engineering of pyruvate carboxylation, oxaloacetate reductio

13、n, and malate export. Appl. Environ. Microbiol., 2008. 74(9): 2766-2777.18.Vemuri GN, Eiteman MA, Mcewen JE, Olsson L, Nielsen J. Increasing NADH oxidation reduces overflow metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2007. 104(7): 2402-2407.19.Medina VG, Almering MJH, Va

14、n Maris AJA, Pronk JT. Elimination of glycerol production in anaerobic cultures of a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use acetic acid as an electron acceptor. Appl. Environ. Microbiol., 2010. 76(1): 190-195.20.Rico J, Pardo E, Orejas M. Enhanced production of a plant monoterpene by over

15、expression of the 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase catalytic domain in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 2010. 76(19): 6449-6454.课题的意义及我国在这方面已进行的工作情况：a-酮戊二酸是一种重要的有机酸，在食品、医药、化工和化妆品等行业都有广泛应用。中晚期肾病患者或肝功能不全患者在日常膳食中补充a-酮戊二酸可以减少肾脏负担，改善生活质量，有效延长寿命。健康人群在高强度体力劳动后补充a-酮戊二酸可以帮助

16、迅速恢复体力，避免过度疲劳产生的安全事故和慢性疲劳综合症。这两大应用导致目前国际市场对a-酮戊二酸的需求不断增加。此外，a-酮戊二酸还广泛用于生物化工的中间体，如作为酶法合成头孢类抗生素的前体等。由于化学法合成a-酮戊二酸过程中存在严重的安全问题，无法直接用于食品和化妆品中。因此，基于发酵法生产a-酮戊二酸在食品和保健品行业具有广阔的应用前景。目前，国内研究主要集中于利用光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)来合成a-酮戊二酸。刘立明等人利用T. glabrata发酵产丙酮酸时，发现发酵液中会同时积累一定量的a-酮戊二酸。进一步研究表明，作为pH缓冲剂的CaCO3，能够增强丙酮

17、酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)的活性，从而增大丙酮酸通过羧化途径进入TCA循环的代谢通量，最终导致了a-酮戊二酸的大量积累。在此研究基础上，梁楠等人通过在T. glabrata胞内过量表达酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的乙酰辅酶A 合成酶基因(ACS2)，提高了胞内乙酰辅酶A的水平，导致碳代谢流从丙酮酸节点更多地流向了a-酮戊二酸节点，有效地提高了a-酮戊二酸的产量。张旦旦等人采取了类似的调控策略，一方面在T. glabrata中过量表达丙酮酸脱羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)，另一方面在培养基中添加了PC的

18、辅因子生物素、丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase，PDH)的辅因子硫胺素和a-酮戊二酸脱氢酶复合体(a-ketoglutarate dehydrogenase，KGDH)的抑制剂过氧化氢。不仅加大了底物的利用速率，促进了菌体的生长和代谢，而且有效地抑制了a-酮戊二酸的进一步代谢，最终胞外a-酮戊二酸的浓度达到37.7 g/L，实现了a-酮戊二酸的高产。国外的研究动态及发展趋势：目前，国外研究主要集中于利用解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)来生产a-酮戊二酸。研究内容主要集中以下三个方面：(1) 揭示 Y. lipolytica产a-酮戊二酸的机

19、理；(2) 优化产酸的营养和环境条件；(3) 阐述Y. lipolytica产a-酮戊二酸时的生理特征。Chernyavskaya等人研究了Y. lipolytica N1在以乙醇为唯一碳源时，硫胺素、pH、氮源浓度以及溶氧对最终产酸的影响。结果表明，硫胺素和铵离子浓度是影响产酸的关键因素，硫胺素的浓度会影响代谢途径上的关键酶(KGDH和PDH)的活性，而铵离子的浓度决定了胞内的代谢流向生成柠檬酸还是a-酮戊二酸。最终他们得出Y. lipolytica N1积累a-酮戊二酸的必要条件是硫胺素不足和氮源过量。在优化的条件下，a-酮戊二酸的产量达到了49.0g/L，对乙醇的产率为42%。正如上面所

20、述，Y. lipolytica N1在不同的条件下可以积累柠檬酸或者a-酮戊二酸，于是Finogenova等人又对胞内中心代谢途径中的酶进行了研究，进而从微生物生理学的角度来揭示菌体产酸时的代谢情况。他们分别在Y. lipolytica N1产柠檬酸和产a-酮戊二酸的条件下，测定了胞内TCA循环和乙醛酸循环中关键酶的活性，经过比较发现：在产柠檬酸阶段，柠檬酸合成酶的活性较高，而TCA循环中其他酶的活性都相对较低；在产a-酮戊二酸阶段，柠檬酸合成酶和KGDH的活性较低，而依赖于NADPH的异柠檬酸脱氢酶(ICD)的活性较高。此外，在这两种情况下乙醛酸循环中的关键酶苹果酸合成酶和异柠檬酸裂解酶的的

21、活性都很低，说明在产酸阶段乙醛酸循环是受到抑制的。在综合分析了酶活和环境之间的关系后，作者认为：在硫胺素不足，菌体生长受到限制的条件下，为了消除环境中过量的铵离子对细胞的毒害作用，菌体会加快胞内的氮代谢。而由谷氨酸脱氢酶催化的a-酮戊二酸生成谷氨酸是氮代谢的关键步骤，这就导致了a-酮戊二酸的大量合成。开题报告1 立题的依据，选题必须对国民经济或在学术上有一定意义。a-酮戊二酸又称a-胶酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸，为白色或类白色的结晶或结晶性粉末，无色，易溶于水。a-酮戊二酸在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，是三羧酸循环(TCA)的重要中间产物之一，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生

22、素的合成以及能量代谢，在微生物细胞的碳氮代谢调控中起着重要的作用。a-酮戊二酸在食品、医药、有机合成、化妆品和饲料等工业中都有着广泛应用。目前工业上生产a-酮戊二酸主要采用化学合成的方法，但是低产量和大量使用有毒有害的化学试剂限制了它的发展空间。而微生物发酵法正以其独特的优势：高产量、低能耗、可持续发展等受到越来越多的关注。在a-酮戊二酸代谢过程中存在两个重要的节点：一是由丙酮酸脱氢酶复合体(Pyruvate dehydrogenase，PDH)催化由丙酮酸生成柠檬酸，这是进入TCA循环的关键节点，二是由a-酮戊二酸脱氢酶复合体(a-ketoglutarate dehydrogenase，KG

23、DH)催化的a-酮戊二酸脱氢反应，其直接导致了a-酮戊二酸的降解。因此，普遍认为高产a-酮戊二酸的关键在于一方面加大碳代谢流进入TCA循环；另一方面减少a-酮戊二酸的进一步代谢。研究表明，PDH和KGDH共同的辅因子硫胺素在a-酮戊二酸积累中起到关键作用。在发酵初期过量的碳源和一定量的硫胺素会促使菌体生长，当菌体生长到一定阶段而硫胺素被大量消耗时，发酵进入由硫胺素控制的生长限制阶段，此时KGDH的活性受到抑制，a-酮戊二酸的进一步代谢受到阻碍，因而实现a-酮戊二酸的大量积累。本实验室早期通过筛选得到了一株高产a-酮戊二酸的菌株，经菌种鉴定命名为解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytic

24、a WSH-Z06），现保藏与中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M207143。该菌能以甘油为唯一碳源，在硫胺素亚适量的条件下，过量积累a-酮戊二酸。在最佳产酸条件下，发酵144 h后a-酮戊二酸产量可达39.3 g/L。但是，发酵过程中会产生大量的副产物丙酮酸。由于丙酮酸是碳代谢流进入TCA循环的关键节点，所以与丙酮酸相关的各条代谢途径都会影响最终碳代谢流进入TCA循环的通量，进而影响a-酮戊二酸的生成。本课题拟通过强化丙酮酸进入TCA循环的通量来提高a-酮戊二酸的产量，一方面过量表达丙酮酸羧化酶强化TCA回补途径；另一方面过量表达乙酰辅酶A合成酶和ATP-柠檬酸

25、裂解酶调控胞内辅因子代谢。2 课题进行的途径，步骤的设想。(1)揭示解脂亚洛酵母积累a-酮戊二酸的机理。从本实验室筛选的a-酮戊二酸高产菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06出发，在其整个发酵过程中，利用定量PCR技术对产酸途径上的关键基因表达量进行定量。与发酵初始比较，寻找影响产酸的关键基因，进一步通过对基因表达量的分析揭示解脂亚洛酵母积累a-酮戊二酸的机理 (2)代谢工程改造解脂亚洛酵母促进a-酮戊二酸的积累。利用已有的解脂亚洛酵母质粒，构建相关基因的表达载体，转化原始菌得到代谢途径得到修饰的重组菌，考察其在合适条件下的发酵性能。(3)重组菌的发酵优化。对(2)中得到的

26、一系列重组菌进行发酵条件的优化，进一步提高a-酮戊二酸的产量。3 需使用的仪器，一般应以选择本院现有仪器及设备为主，估计需要经费多少？完成本课题需要使用的仪器主要包括:PCR仪 美国BIO-RAD公司GelDoc凝胶成像系统 美国BIO-RAD公司DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂DKB-600A型电热恒温水槽 上海森信实验仪器有限公司LRHS-150B恒温恒湿培养箱 上海跃进医疗器械厂台式高速离心机 德国 eppendorf 公司蛋白电泳仪 美国BIO-RAD公司电转仪 美国BIO-RAD公司漩涡混合器 上海琪特分析仪器有限公司制冰机 三洋公司电热恒温鼓风干燥箱 上海贺德实验设备有限公司

27、立式压力蒸汽灭菌锅 上海华线医用核子仪器有限公司722s可见分光光度计 上海棱光技术有限公司KYC100B培养摇床 上海福玛实验设备有限公司HZS-H水浴振荡器 哈尔滨市东明医疗仪器厂DKY-恒温调速回转式摇床 上海杜科自动化设备有限公司Himac CR 22G冷冻离心机 日立公司 定量PCR仪 罗氏公司整个课题完成约需要经费：30,000元4 课题进行时可能出现的问题及准备采取的应变措施。由于本实验室对Yarrowia lipolytica WSH-Z06的生理和代谢研究较少，对其进行代谢工程改造面临以下几个问题：(1)原始菌缺乏稳定的遗传标记，无法直接进行外源基因的表达，所以首先需要通过基

28、因敲除技术得到尿嘧啶或亮氨酸的营养缺陷型菌株，才能进行后续的代谢改造。(2)原始菌未经任何遗传改造，没有成熟的转化体系。(3)鉴于微生物代谢和生理上的复杂性，简单的代谢改造未必能对产酸起到较大的作用，改造效果不一定明显。解决措施：(1)敲除URA3基因，构建尿嘧啶营养缺陷型菌株或者将原有质粒上的URA3标记基因替换成潮霉素B抗性基因，然后利用潮霉素B来筛选重组子。(2)尝试多种转化方法，包括：醋酸锂法、电转法和基因枪等，并优化转化条件，以期探索到一个高效的转化方法。(3)表达不同来源的基因以减少密码子偏好性等因素对基因表达的影响，多拷贝整合提高基因的表达量，强化相关代谢途径。课题与教研室及导师

29、的科研工作有无关系，与已毕业的研究生课题联系：本实验室早期通过筛选得到了一株高产a-酮戊二酸的菌株，经菌种鉴定命名为解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica WSH-Z06），现保藏与中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M207143。该菌能以甘油为唯一碳源，在硫胺素亚适量的条件下，过量积累a-酮戊二酸。在最佳产酸条件下，发酵144 h后a-酮戊二酸产量可达39.3 g/L。论文工作计划阶段工作内容及预计完成的指标：2011年1月-2011年3月 通过定量PCR技术研究产酸关键途径上相关基因的表达情况，揭示解脂亚洛酵母积累a-酮戊二酸的机理。2011年3月

30、-2011年6月 将p0质粒上的URA3标记基因替换成hph基因，并构建p0(hph)-ACS1，p0(hph)-ACL，p0(hph)-PYC1等表达载体。2011年6月-2011年9月 将构建好的载体转化解脂亚洛酵母，得到正确的重组菌。2011年9月-2011年12月 重组菌的发酵优化，进一步提高a-酮戊二酸的产量。2012年 待定审查意见导师或指导小组意见：签 名： 年 月 日中心主任意见： 签 名： 年 月 日责任教授意见： 签 名： 年 月 日论文阶段工作小结（一）：1. 表达载体的构建1.1 替换p0质粒上的标记基因图1 标记基因替换流程图以pBU4-CRE质粒为模板，PCR扩增h

31、ph基因。p0质粒和hph基因经StuI和HindIII双酶切后连接，转化大肠杆菌JM109，经菌落PCR和测序得到正确的转化子。1.2 构建p0(hph)-ACS1，p0(hph)-ACL，p0(hph)-PYC1表达载体以p0(hph)-ACS1构建为例：图2 p0(hph)-ACS1构建流程图以酿酒酵母基因组为模板，PCR扩增ACS1基因，p0(hph)和ACS1基因经EcoRI和NotI双酶切后连接，转化大肠杆菌JM109，经菌落PCR和测序得到正确的转化子。质粒p0(hph)-ACS1经AvrII酶切纯化后可直接用于转化。1.3 转化解脂亚洛酵母采用优化后的电转条件：电压 2200V

32、，点击时间 5ms连续电击两次。电击后的菌体经后培养涂布200mg/mL的潮霉素B 平板。30培养2-4d后挑取单菌落提基因组PCR验证，经PCR验证成功的菌株进行稳定性验证，最终筛选得到稳定性好的重组菌。审查意见导师或指导小组意见： 签 名： 年 月 日中心主任意见： 签 名： 年 月 日责任教授意见： 签 名： 年 月 日论文阶段工作小结（二）：论文阶段工作小结（二）：审查意见导师或指导小组意见： 签 名： 年 月 日中心主任意见： 签 名： 年 月 日责任教授意见： 签 名： 年 月 日论文阶段工作小结（三）：论文阶段工作小结（三）：审查意见导师或指导小组意见： 签 名： 年 月 日中心主任意见： 签 名： 年 月 日责任教授意见： 签 名： 年 月 日论文阶段工作小结（四）：论文阶段工作小结（四）：审查意见导师或指导小组意见： 签 名： 年 月 日中心主任意见： 签 名： 年 月 日责任教授意见： 签 名： 年 月 日17