分子生物学 讲义(2011-2012-2)

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1、实验课程教学讲义单 位 生命科学与技术学院 2011-2012 学年度 第 2 学期专 业 生物技术 班 级 2009级3/4/5/6班 考试科目 分子生物学实验 任课老师 姜 立 春 制定（修改）日期 2012 年 2月20日分子生物学实验室使用规则1. 进入实验室的实验人员，必须听从任课教师的安排，班级干部负责和督促安全和卫生工作，每个学生要严格遵守。2. 必须严格执行仪器设备运行记录制度，记录仪器运行状况、使用时间及使用人员等。发现仪器有故障者，有义务立即向认可老师、管理员或实验室主任报告，严禁擅自处理、拆卸、调整仪器主要部件，凡自行拆卸者一经发现将给予严重处罚。仪器用后切断电源，各种按

2、钮回到原位，并做好清洁工作。3. 实验室公用物品用完之后按原样放回，不得擅自借出或带出到其它实验室。在确实需要的情况下，应向实验室管理人员提出请求。4. 使用易燃易爆气体时，盛装气体的气瓶应与实验室相应设施隔离。使用电炉、酒精灯等要远离化学易燃物品。5. 所有实验室存储的样品、试剂必须如实写好标签，如样品应有样品名称、存放时间、存放人。配制的试剂应有试剂名称、浓度、配制时间和配制人等。6 所有在实验室冰箱或冰柜里存放的物品用完后需及时处理。实验室管理人员将定期清理无标识和过期的样品。7. 实验室使用有毒物质或进行能产生有危害气体的实验，应在不燃结构的通风橱内进行。8. 实验过程所产生的感染性培

3、养物、菌株及相关生物制品及其它具感染性实验室废弃物，应视为医疗垃圾进行相应的特定处理。9. 带有放射性的废弃物必须放入指定的具有明显标志的容器内封闭保存，报有关部门统一处理。10. 实验室内禁止吸烟、用餐，保证通风洁净，闲杂人员不得入内。11. 实验工作完毕后，做好整理工作，关闭电源、水源、气源和门窗。12. 实验室人员应保证消防通道畅通，消防设施齐全。如发生意外事故，应立即采取必要措施，并及时报告实验室负责人、值班人员和报警。仪器使用注意事项分子生物学操作中会涉及一系列仪器，使用不当导致实验失败、减少仪器使用寿命或损坏仪器。因此在进行操作前细致地了解各种仪器的使用方法及注意事项，是使后继实验

4、事半功倍的一个必要准备。冷冻离心机低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中，都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机已成为分子生物学研究中必需的重要工具。使用方法：1. 离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。2. 打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先以托盘天平平衡好的样品放置于转头样品架上（离心筒须与样品同时平衡），关闭机盖。3. 按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。4. 按启动键，离心机将

5、执行上述参数进行运作，到预定时间自动关机。5. 待离心机完全停止转动后打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。注意事项：1. 机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线。2. 开机前应检查转头安装是否牢固，机腔有无异物掉入。3. 样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。4. 挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏，以免腐蚀机腔或造成事故。5. 擦拭离心机腔时动作要轻，以免损坏机腔内温度感应器。6. 每次操作完毕应作好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。7. 离

6、心过程中若发现异常现象，应立即关闭电源，报请有关技术人员检修。附：相对离心力与每分钟转速的换算离心机的转速，在以前实验资料中一般以每分钟多少转来表示。由于离心力不仅为转速函数，亦为离心半径的函数，即转速相同时，离心半径越长，产生的离心力越大。因此仅以转速表达离心力是不够科学的，近年来主张用相对离心力（RCF）来表示比较合理。现在国际资料中，已改用相对离心力来表示。两者的互换公式如下：N=RCF105/1.18RRCF=0.00001118RN2N表示转速，单位为转/分（r/min）；R表示离心半径，即离心管底端至轴心的距离，单位为厘米（cm）；RCF表示相对离心力，单位用重力加速度Xg(g=9

7、.8m/s2)。电泳仪：电泳技术是分子生物学研究不可缺少的重要分析手段。电泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类，自由界面电泳不需支持物，如等电聚焦电泳、等速电泳、密度梯度电泳及显微电泳等，这类电泳目前已很少使用。而区带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶电泳。所谓电泳，是指带电粒子在电场中的运动，不同物质由于所带电荷及分子量的不同，因此在电场中运动速度不同，根据这一特征，应用电泳法便可以对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组份分析或单个组份提取制备，这在临床检验或实

8、验研究中具有极其重要的意义。电泳仪正是基于上述原理设计制造的。下面简单介绍其使用方法及注意事项。使用方法1. 首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。2. 电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。3. 接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。4. 工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。注意事项1. 电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。同时要求仪器必须有良

9、好接地端，以防漏电。2. 仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。3. 由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。4. 在总电流不超过仪器额定电流时（最大电流范围），可以多槽关联使用，但要注意不能超载，否则容易影响仪器寿命。5. 某些特殊情况下需检查仪器电泳输入情况时，允许在稳压状态下空载开机，但在稳流状态下必须先接好负载再开机，否则电压表指针将大幅度跳动，容易造成不必要的人为机器损坏。6. 使用过程中发现异常现

10、象，如较大噪音、放电或异常气味，须立即切断电源，进行检修，以免发生意外事故。微移液器基本使用方法1) 选择适当的Pipetman：同型号的微移液器，各有其吸取体积范围，请依取用溶液体积取用适当的微移液器。P10 0.5 10；P20 2 20；P10020 200；P1000 100 1,000。2) 设定体积：设定体积时，由低旋转至高值，须先超越所欲设定值至少三分之一转后，再反转至设定值；由高旋转至低值，则直接转至设定值即可。请勿将体积调整圈转到超过最低或最高的使用范围。3) 套上微移液器头，吸取溶液： 吸取溶液时，尖端请先套上微移液器头 (tip)，P1000 使用色微移液器头，P200

11、及P20 使用黄色微移液器头。将按钮压至第一段，尽可能保持微移液器垂直，将微移液器头尖端浸入溶液，再缓慢释放。释放按钮可太快，以免溶液冲入吸管柱内而腐蚀活。微移液器头尖端浸入溶液的程随吸取的体积及使用型号而定：4) 释放溶液： 将微移液器头 与容器壁接触，慢慢压下按钮至第一段，停一秒再压至第二段，把溶液完全压出。使用注意事项1) 勿将微移液器本体浸入溶液中。2) 吸取黏高之试液，请先将微移液器头尖端以刀片或剪刀将出口大，并先预润后再吸取。3) 吸取酸液或具腐蚀性溶液后，请将微移液器拆解开，各部位件以蒸馏水冲洗干净，擦干后再正确组合回原。4) 微移液器的任何部份勿用火烧烤，亦可吸取温高于70的溶

12、液，避免蒸气侵入腐蚀活。5) 套有微移液器头的微移液器，无微移液器头中是否有溶液，均可平放，需直架好。6) 小心使溶液进入吸管柱内时，应予以拆解，将活组件、吸管柱、O-ring、铁氟垫等各部位以清水冲洗干净后，再以酒擦拭，擦干后再正确组合回原。7) 定期自以天平检查准确，有任何问题请送厂维修。微移液器Pipetman P 的使用A, 保持微移液器垂直，将按钮压至第一段；B, 微移液器头尖端浸入溶液，缓慢释放按钮；C, 保持微移液器垂直，将微移液器头与容器壁接触，慢慢压下按钮至第一段；D, 压至第二段把溶液完全释放出；E, 释放按钮回原。 其他仪器的使用和注意事项看相关工具书或在网上查看。实验0

13、1 细菌基因组DNA的制备基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边

14、都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。一、材料 细菌培养物。 二、设备

15、移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 三、试剂 1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O，缓慢加入10g CTAB，加水至100ml。 2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 四、操作步骤1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37保温1小时。

16、3. 加1.5ml 5mol/L NaC，混匀。 4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液，混匀，65保温20分钟。 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，5000rpm离心10分钟，将上清液移至干净离心管。6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清液移至干净管中。7. 加1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8. 用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗后，吸干，溶解于1ml TE，-20保存。如DNA沉淀无法捞出，可5000rpm离心，使DNA沉淀。 9. 如要除去其中的RNA，加RNA酶处理。 实验02 质粒DNA的碱裂解法小量制备一 实验原理

17、在强碱性环境中，核酸等生物大分子易于变性，DNA分子易发生氢键的断裂而形成单链分子，但是处于超螺旋状态的质粒DNA分子受此影响不大；添加过酸性缓冲液后，染色体DNA、蛋白质等大分子难于复性，相互缠绕形成复合物，而质粒DNA分子依然受影响不大，此时可以借助离心等手段，使DNA、RNA和蛋白质等复合物沉淀下来，而超螺旋状态的质粒依然保留在上清液中，从而达到分离的目的。二、实验目的 学习并掌握碱裂解法制备质粒DNA的原理和方法，学会相关实验现象的观察与分析。三、实验材料1）菌种 由实验室提供溶液 50mmol/L葡萄糖 25mmol/L TrisCl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.

18、0) 溶液可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。2）加200l新配制的溶液。 溶液 0.2 mol/L NaOH（临用前用10 mol/L贮存液现用现稀释） 1% SDS 盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液接触。不要振荡，将离心管放置于室温3min。 3）加150l用冰预冷的溶液 溶液 5mol/L乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL （所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸

19、根是5mol/L ）三实验步骤1. 取用1.5mL菌液于EP tube 12000g 4离心2min去上清，再瞬时离心彻底去上清；2. 加裂解液 bufferI 150L 用枪头吹散混匀；3. 加入150L 2%SDS，150L 0.4mol/L NaOH颠倒混匀5次（现配现用）；4. 加入 bufferIII，200L颠倒混匀，冷水浴3-5分钟；5. 取出12000g 4离心7min上清液转移新的EP中；6. 12000g 4 离心6min，上清液新的EP管中。7. 加入无水乙醇900uL混匀；（醇沉）8. 放入冰箱-20，10min(冰水混合物中也可以)；9. 取出4，12000g离心9m

20、in，去上清。10. 加70%的乙醇800uL；(洗涤)11. 12000g 4 离心4min；12. 无菌室风干，溶于ddH2O或TE buffer中。四、注意事项1Buffer I 、II、III的体积是具有特定比例的，为1：2：1.5；2多次用到冰水浴，其原因在于冰水浴的温度为0摄氏度，此时大多数核酸酶活性极低，接近无活性，对于保持核酸的稳定是极为重要的；3加入Buffer I后，振荡后无明显可见菌体颗粒；加入Buffer II后置于室温3min，反应体系是澄清的；加入Buffer II、 III后，忌振荡剧烈。实验03 琼脂糖凝胶电泳一、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段

21、的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(et

22、hidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb50kb范围内的DNA片段。本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。二、仪器及试剂1. 仪器及耗材水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。2. 试剂及配制50TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）

23、配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温保存。1TAE缓冲液的配制：称量20 ml的50TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。溴化乙啶贮存液：10 mg/ml 溴化乙啶配制：100 ml称取1 g溴化乙啶，置于100 ml烧杯中，加入80 ml去离子水后搅拌溶解。将溶液定容至100 ml后，转移到棕色瓶中。室温保存。6上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。配制：10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 m

24、l用6TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20保存。其它试剂：DNA样品、DNA Ladder 、琼脂糖、三、操作步骤1. 制备1琼脂糖凝胶(大胶用70ml，小胶用50ml)：称取0.7 g（0.5 g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml（50ml）1TAE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液。2. 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将冷却到65左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展

25、开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。3. 加样：在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60100V，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1c

26、m处时，停止电泳。5. 电泳完毕后，取出凝胶，用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1TAE溶液染色约20 min，再用清水漂洗10 min。6. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。四、常见问题及注意事项1配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。2琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。3电泳时应注意电源线路，预防触电。4溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验室内使用。5紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。6DNA带形状模糊：DNA加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。7质粒DNA的存在形式有3种，共价闭环DN

27、A（cccDNA），常以超螺旋形式存在；开环DNA（ocDNA），此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子；线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带，它们的泳动速度为：cccDNA 线状DNA ocDNA。实验04 多聚酶链式反应(PCR)基因扩增一、实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。 二、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下： PCR循环过程

28、中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。 1变性：加热使模板DNA在高温下（94-95）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。 2退火：在体系温度降至37-65，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。 3延伸：体系反应温度升至中温72，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，

29、样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是

30、利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。 三、实验材料及相关试剂 基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等。 四、实验步骤 1模板DNA的抽提：实验一所得的基因组DNA。 2PCR操作(在冰上操作)： 1）PCR反应混合液的配制：反应体系25L，在无菌的0.2mL离心管中按下列操作程序加样：2）将反应混合液混匀，后每个PCR管中分装24 L反应混合液

31、，再加1 L模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发，然后稍离心。3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：五、注意事项 由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。 a. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。 b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。 c. 每加一种反应物，应换新的枪头。 实验05 DNA酶切及检测一、DNA的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类：类和类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修

32、饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶(限制酶)，它切割某一特异的核苷酸序列，另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列：5- GAATTC-3)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3)；有的

33、切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5GAATTC3 5 G AATTC33CTTAAG 5 3 CTTAA G5DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度,

34、再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内

35、切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1g。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37)。对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1g DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。DNA酶切反应 1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用

36、微量移液枪分别加入DNA 1g和相应的限制性内切酶反应10缓冲液2l，再加入重蒸水使总体积为19l，将管内溶液混匀后加入1l酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。 3、每管加入2l 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应,置于冰箱中保存备用。二、实验目的了解DNA的限制性内切酶操作及酶切检测的方法。三、酶切步

37、骤1. 30u反应体系plasmid (2.7kb) 5uL10H buffer 3uLHind III 1.2uLddH2O 21.8uL2. 37水浴 46小时 不时弹动3. 65水浴 10min 冰浴2min4. 12000g 4 2min5. 电泳检测6. 凝胶成像仪照相，记录。实验06 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化引言在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化(Tran

38、sformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R, M)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2、RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化

39、后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率，实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于4的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数

40、生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3. 试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分

41、装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，并用CaCl2处理,使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导

42、入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。一、材料、设备及试剂 1. 材料E. coli DH5菌株： R, M, Amp；pBS质粒DNA：购买或实验室自制，eppendorf管。 2. 设备恒温摇床，电热恒温培养箱，台式高速离心机，无菌工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪。 3. 试剂1) LB固体和液体培养基2) Amp母液3) 含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60左右，加入Amp储存液，使终浓度为50ug/ml，摇匀后铺板。 4) 麦康凯培养基(Maconkey Agar)：取52g麦康凯琼脂，加

43、蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全溶解，高压灭菌，待冷至60左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml，然后摇匀后涂板。 5) 0.05mol/L CaCl2溶液：称取0.28g CaCl2(无水,分析纯)，溶于50ml重蒸水中，定容至100ml，高压灭菌。6) 含15%甘油的0.05mol/L CaCl2：称取0.28g CaCl2(分析纯)，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌。二、操作步骤 1. 受态细胞的制备1) 取出在-80C存储的E.coli菌株，在LB平板上化线。37C培养过夜2) 挑取单菌落到5ml SOB culture medium 37C，

44、振荡培养6-8小时3) 取2ml加入100ml SOB（加Mgcl2）培养基内，18C摇床培养 OD=0.54) 取出放到冰水中10min，3000rpm，4离心15min，彻底除上清5) 沉淀中加入初菌液总体积的1/3的TB，冰浴约10min6) 3000rpm，4C 离心15min，去上清7) 沉淀溶于TB中8) 冰水浴10min9) 加7%终体积DMSO，边加边摇10) 冰水浴10min11) 0.5ml/管分装于预冷过后Eppendorf管（1.5ml）12) 液氮-80C储存TB BufferPIPES 0.3g Cacl2.2H2O 0.22gKcl 1.86g溶于95ml ddH

45、2O 190ml，加KOH调PH=6.7，加Mncl2.4H2O 1.09g，加入ddH2O到100ml, 0.22um滤膜过滤，4C保存。三、转化1) 从-80C冰箱内取出DH5a Competent Cell冰浴中解冻；2) 将10ul转化物和100ul competent cell加入1.5mlEP管中混匀；3) 冰水浴20min；4) 42C水浴22s，再冰浴2min；5) 加入900ul SOC Culture medium 轻轻混匀；6) 转入50ml尖底管中，37C 振荡1h；7) 涂平板（LB+Amp），平板先预热，37C培养过夜（16h）。实验07 单序列分析及多序列比对一、

46、 实验原理1 BioEdit软件是一个性能优良的免费的分子生物学应用软件，可对核酸序列和蛋白质序列进行常规的分析操作。2 BioEdit 7.0.5.2软件可以将所输入的DNA序列翻译成蛋白质序列、进行DNA序列中各种碱基成分的百分含量分析、限制性内切酶酶切位点图谱的分析。3 BioEdit 7.0.5.2软件可以将所输入的蛋白质序列进行氨基酸组成分析、分子量预测等；4 BioEdit 7.0.5.2软件可以将所输入的多个DNA序列或者蛋白质序列进行多序列比对分析。二、 实验目的 使用BioEdit 7.0.5.2软件软件，对功能相关的序列进行多序列比对分析，包括DNA序列（限制性酶切位点、O

47、RF）、蛋白质序列及单条序列的特征（分子量、pI、motif等）、多条序列的保守区、变异区分析。三、 实验条件 BioEdit 7.0.5.2软件; 多媒体网络教室。四、实验步骤1DNA序列的分析（1）点击并激活程序；(退出以下所有命令时都不许保存)（2）点击“Files”菜单下“Open”命令，在弹出的对话框中选择目的DNA序列的路径，选中目标后，点击“确定”。（3）选中已经输入的目的序列，点击“Sequence”菜单下“Nucleic Acid”命令中“Nucleotide Composition”子命令，软件运行并将自动弹出两种对话框，如下：其中左边是数据结果，右边为柱状分析图。（4）选

48、中已经输入的目的序列，点击“Sequence”菜单下“Nucleic Acid”命令中“Translation”子命令，先后选中Frame1、Frame2或者Frame3，如下图：是翻译后的蛋白质序列及密码子偏好性分析。（5）选中已经输入的目的序列，点击“Sequence”菜单下“Nucleic Acid”命令中“Restriction Map”子命令，软件将会弹出结果。2蛋白质的序列分析（1）点击“Files”菜单下“Open”命令，在弹出的对话框中选择目的Protein序列的路径，选中目标后，点击“确定”。（2）选中已经输入的目的序列，点击“Sequence”菜单下“Protein”命令中

49、“Amino Acid Composition”子命令，软件运行后将自动弹出两种对话框，一种是数据结果，另外一种为柱状分析图；（3）上述两种结果图中都有蛋白质分子量的预测结果。3多序列比对分析（1）点击“Files”菜单下“Open”命令，在弹出的对话框中选择目的DNA序列的路径，选中目标后，点击“确定”；（2）点击“Files”菜单下“Import”命令中“Sequence Alignment File”子命令，在弹出的对话框中选择目的DNA序列的路径，按“Ctrl”键并选中多个目标后，点击“确定”；（3）选中输入后的多条序列，点击“Accessory Application”菜单下“Clu

50、stalW Multiple Alignment”命令；（4）在新弹出的对话框中点击“Run ClustalW”命令，程序自动运行，并在新对话框中输出结果；（5）分析输出结果中的多条序列之间高度保守的区域及其非保守区域。五、实验内容1. 需要进行分析的DNA 序列ATGCTCAAGCGAATTTCCAGCCCCGCCCTGCTCGCCTTGGCCCTGTTTGGCGGTGCCGCGCACGCCGCGCTGGTACCCCCACAGGGTTACTACGAAGGGATCGAAAAACTCAAGACCAGCGATGGTAACTTCCGCTGTGAAGCGGCGCCCAAGCCCTATACCGGTGCG

51、CTGCAGTTCCGTAGCAAGTACGAAGGCTCGGACAAGGCACGGGCAACGCTCAACGCAGCCTCGGAAAAGGCCTTTCGCAAGTCGACCGAAGACATCACCACCCTTGAGAAAGGCGTGAGCAAGATGGTTGGCCAGTACATGCGCGACGGCCGCCCGGCGCAGCTCGACTGCACCCTGACGTGGCTGGGCACCTGGGCGCGCGCCGATGCGTTGATGTCCACCGACTACAACCACACCGGCAAGTCGATGCGCAAATGGGCGCTGGGCAGCATGAGCGGTTCGTGGCTGCGCCTGAAGTTC

52、TCCAACTCGCAGCCCTTGGCCGCGCACCGCGCCGAGGCCGAGCTGATCGAAAAATGGTTCGCCCGCCTGGCCGAGCAGACCGTGCGCGACTGGAGCGACCTGCCGCTGGAGAAGATCAACAACCACAGCTACTGGGCAGCCTGGTCAGTCATGGCGACCGCTGTCGCCACCGACCGTCGCGACCTGTTCGACTGGGCCGTGAAGGAATACAAGGTAGGCGCCAACCAGGTGGATGACCAGGGCTTCCTGCCCAACGAAATCAAGCGCAAGCAGCGTGCGCTGGCCTACCACAACTACGCC

53、CTGCCGCCGCTGGCGATGATTGCCAGCTTCGCCCAGGCCAATAACGTCGACCTGCGCAGCGAGAACAACTTCGCCCTGCAGCGCCTGGGCGAAGGGGTACTGGCCGGTGCACGCGACCCCAGCCACTTCAAGGCCCGCGCGGGTGAAAAACAGGACATGACCGACCTCAAGGTCGACGGCAAGTACGCCTGGCTCGAGCCCTGGTGTGCGCTTTATCACTGTGTCGGCGACACGCTTGATCGCAAGCAGCACATGCAGCCGTTCAACAGCTTCCGGCTGGGCGGCGACCTGACCCGGGTC

54、TACGACCCGAACGCAGAGAGCAAAAAATGA2需要进行分析的蛋白质序列MLKRISSPALLALALFGGAAHAALVPPQGYYEGIEKLKTSDGNFRCEAAPKPYTGALQFRSKYEGSDKARATLNAASEKAFRKSTEDITTLEKGVSKMVGQYMRDGRPAQLDCTLTWLGTWARADALMSTDYNHTGKSMRKWALGSMSGSWLRLKFSNSQPLAAHRAEAELIEKWFARLAEQTVRDWSDLPLEKINNHSYWAAWSVMATAVATDRRDLFDWAVKEYKVGANQVDDQGFLPNEIKRKQRALAYHNYAL

55、PPLAMIASFAQANNVDLRSENNFALQRLGEGVLAGARDPSHFKARAGEKQDMTDLKVDGKYAWLEPWCALYHCVGDTLDRKQHMQPFNSFRLGGDLTRVYDPNAESKK-3需要进行多序列比对的5条Protein序列（1） 1 mktrlalpcl lgslllssav haasalvppk gyyaaleirk geaqacqavp epytgelvfr 61 skyegsdsar stlnkkaeka fraktkpite iergvsrmvm rymekgrlrr agmrpgllda 121 waeddallst eynhtgksmr kw

56、algslaga ylrlkfstsq plaaypeqak rieawfakvg 181 dqvikdwsdl plkqinnhsy waawsvmaag vatnrrplfd waveqfhiaa kqvdprgfla 241 nelkrrqral ayhnyslppl mmiaafaqan gvdlrgdndg algrlagnvl agvedpepfa 301 eragedqdme dletdakfsw lepycalyac spalrerkae mgpfknfrlg gdvtrifdpq 361 ekpskstvgn ad（2） 1 mhktrlalsc llgslllsga vha

57、aealvpp kgyyapvdir kgeapacpvv pepftgelvf 61 rskyegsdaa rstlneeaek afrtktapit qiergvsrmv mrymekgrag dlectlawld 121 awaedgallt teynhtgksm rkwalgslag aylrlkfsss qplaaypeqa rrieswfakv 181 gdqvikdwsd lplkrinnhs ywaawavmaa gvatnrrplf dwaveqfhia agqvdsngfl 241 pnelkrrqra layhnyslpp lmmvaafala ngvdlrgdnd ga

58、lgrlagnv lagvekpepf 301 aeragdedqd medletdakf swlepycaly scspalrerk aemgpfknfr lggdvtrifd 361 paeksprstv gkrd（3） 1 mktshliria lpgalaaall asqvsqaadl vpppgyyaav gerkgsagsc pavpppytgs 61 lvftskyegs dsaratlnvk aektfrsqik ditdmergat klvtqymrsg rdgdlacaln 121 wmsawaraga lqsddfnhtg ksmrkwalgs lsgaymrlkf ss

59、srplaaha eqsreiedwf 181 arlgtqvvrd wsglplkkin nhsywaawsv mstavvtnrr dlfdwavsef kvaanqvdeq 241 gflpnelkrr qralayhnya lpplamiapf aqvngvdlrq enhgalqrla ervmkgvdde 301 etfeektged qdmtdlkvdn kyawlepyca lyrcepnacs rpkkdrepfn sfrlggevtr 361 vfsreggs（4） 1 mqtpklirpt llsmailssm awatgasaal vppkgydapi ekmktgdh

60、nf sceaipkpyt 61 dklvfrskye gsdkaratln avseeafrda tkdittlerg vskvvmqymr dgrpeqldca 121 lnmmttwaka dalesrefnh tgksmrkwal gsmssaylrl kfseshplan rqqdakiiet 181 wfskladqvv sdwsnlplek innhsywaaw svmatavatn rqdlfdwavk eykvaanqvd 241 kdgflpnemk rrqralsyhn yalpplamia sfaqangvdl rpenngalkr lgdrvlagvk 301 dps

61、ifaehng ekqdmtdlkk dpkfawlepy cslytcspdv leekhekqpf ktfrlggdlt 361 kvydpthekg dkgdndgs（5） 1 mrnpklknll aptllslamf agatqaaapl rppqgyfapv dkfktgdksd gcdampapyt 61 gplqfrskye gsdkaratln vqsekafrdt tkdittlerg takrvmqfmr dgrpeqlect 121 lnwltawaka dalmskdfnh tgksmrkwal gsmassyirl kfsdshplaq hqqeaqliea 181 wfskmadqvv sdwdnlplek tnnhsywaaw svmatavatn rrdlfdwavk eykvgvnqvd 241 adgflpnelk rqqralayhn yalpplamia sfaqingvdl rqenngalkr lgdrvlagvk 301 dpdefeekng kkqdmtdlke dmkfawlepf ctlytcapdv iekkrdmqpf ktfrlggdlt 361 kvydpshekg nkgs实验08 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳一、实验目的1. 了解电泳实验原理；2. 掌握电泳实验操作规程；3. 用电泳方法测定蛋白分