五灵脂与人参配伍化学成分及体外药理活变化研究硕士博士学位0066259

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1、硕士（博士）学位论文五灵脂与人参配伍化学成分及体外药理活性变化研究Study on compatibility of trogopterus dung and panax ginsengchanges in chemical and pharmacological activity in vitro 独 创 性 声 明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何

2、贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日关于论文使用授权的声明1、 本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人 （同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉

3、密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日导师签名： 签字日期： 年 月 日五灵脂与人参配伍化学成分及体外药理活性变化研究摘 要五灵脂与人参，是中药十九畏中临床应用较多的一对配伍，本论文对五灵脂与人参配伍进行了实验研究，可为临床合理配伍提供科学有效的重要依据。本论文包括化学实验研究和药理实验研究两大部分。在化学方面主要进行了以下研究：1.运用硅胶柱层析法分别从五灵脂的乙酸乙酯提取物中分离得到2个化合物，分别为：-谷甾醇和原儿茶酸；从人参中分离提取得到3个化

4、合物，分别为：人参皂苷Rd、Rc、Rb1。2.本论文对五灵脂脂肪酸及其他脂溶性成分进行了GC-MS分析，鉴定出42种化合物，其中脂肪酸15种，占脂溶性成分总含量的49.162%，非脂肪酸类成分27种，占脂溶性成分总含量的44.184%。本论文还采用水蒸气蒸馏法提取了五灵脂的挥发油。3.本论文通过中医药数据库中五灵脂与人参配伍应用的方剂考证，选取了4个应用较广泛的配伍比例，分别为：五灵脂与人参配伍5:1、3:1、1:1、1:3。并分别用紫外分光光度法、高效液相法对不同比例配伍后样品中的总黄酮、原儿茶酸、总皂苷和9种单体皂苷的含量变化进行了考察，结果表明：对人参皂苷的含量测定表明：二者并用后使人参

5、皂苷类活性成分含量普遍降低，总皂苷及不同配伍比例的人参皂苷类活性成分降低程度有区别；但配伍比例变化与含量变化并不成线性关系，且经配伍后的样品中人参皂苷Rb3含量明显升高。对总黄酮的含量测定表明：配伍后溶液中的总黄酮含量变化显著，但并不成线性相关，且五灵脂与人参配伍为3:1时，溶液中总黄酮含量达到一个接近于单一五灵脂溶液中的总黄酮含量值。对原儿茶酸的含量测定表明：配伍后溶液中的原儿茶酸含量变化显著，且五灵脂与人参配伍为5:1，3:1，1:1时，溶液中的原儿茶酸含量都明显高于单味五灵脂中的原儿茶酸含量。在药理实验方面主要进行了以下研究：1.抗氧化方面，本论文采用DPPH法，对五灵脂不同溶剂提取物及

6、其挥发油、五灵脂与人参不同比例配伍后的醇提物进行体外抗氧化活性研究，结果表明：各组分均对DPPH自由基有清除能力。五灵脂的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物对DPPH有较强的清除能力；五灵脂的清除DPPH自由基能力比人参更好，合用后，随着五灵脂量的减少，添加人参量的增加，其清除DPPH的能力逐渐减弱。2.抑菌方面，本文选择了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对五灵脂不同溶剂提取物及其挥发油、五灵脂与人参不同比例配伍后的醇提物的体外抑菌活性进行研究，结果表明：各组分对大肠杆菌ATCC8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538均表现出不同的抑制其生长的活性。五灵脂不同溶剂提取物中，氯仿提取物和乙酸乙酯提取物对两种菌

7、的抑菌效果都尤为显著，其中在氯仿提取物浓度为25 mg/ml时，对两种菌的抑制率都最高，达到60.06%和57.81%，与空白对照组比较有极显著差异（P0.01）；五灵脂的挥发油对大肠杆菌ATCC8099和金黄色葡萄球菌ATCC6538的生长均具有抑制作用，但抑菌效果并不明显；五灵脂与人参的醇提物对两种菌的生长也都具有抑制作用，但五灵脂与人参二者醇提物比较，五灵脂醇提物的抑菌作用明显优于人参醇提物抑菌作用，随着配伍比例中五灵脂量的减少，配伍后的醇提物对两种菌生长的抑制作用也逐渐降低，以5:1配伍的醇提物浓度为25 mg/ml时，抑制率最高，达到73.55%和60.58%，与空白对照组比较有极显

8、著差异（P0.01），且以5:1比例配伍的醇提物，其抑菌效果最为显著甚至强于单一五灵脂的抑菌效果。关键词：五灵脂，人参，化学成分，配伍实验，抗氧化活性，抑菌活性Study on compatibility of trogopterus dung and panax ginsengchanges in chemical and pharmacological activity in vitroAbstract Trogopterus dung and Panax ginseng, is one pair of nineteen herbs of mutual antagonism. Was pr

9、escription in common use in clinical practice. Experiments on compatibility of the tow medicines were practiced and summarized in this thesis.Chemical and pharmacology studies are tow main parts of the thesis. In chemical works, tow compounds were isolated from EtOAc fraction of trogopterus dung abs

10、tract they were Beta sitosterol and proto-catechuic acid. Three compounds were isolated from Ginseng abstract, they were saponin Rd, Rc and Rb1. Fat-soluble composition in trogopterus dung was analysed by GC-MS method, 42 compounds were identified and 15 of them were fat-acid, with a content of 49.1

11、62 percent. Volatile oil in trogopterus dung was extracted by steam distillation. Four commonly used compatibility proportion of the tow medicines were compared, 5:1, 3:1, 1:1 and 1:3. Variation of content of total flavonoid and saponin were determined by UV, while content of protocatechuric acid an

12、d other nine saponins were determine by HPLC. Results showed under polypharmacy condition, saponin in ginseng declined except Rb3, and there was no linear relationship between proportion and the content. Content of protocatechuric acid varied as change of compatibility proportion, under condition of

13、 5:1, 3:1 and 1:1, protocatechuric acid in extract had a higher content than in single trogopterus dung.In pharmacology study, antioxidation activity was tested by DPPH method. Activity of extracts from trogopterus dung by different solvent, volatile oil, and different compatibility proportion were

14、compared, EtOAc and n-BuOH fraction of trogopterus dung had stronger activity in eliminating DPPH radical, and the activity decreased as gingseng goes to a higher proportion in compatibility. Bacteriostatic study was carried on colibacillus and staphylococcus aureus, all above groups performed inhib

15、ition, chloroform and ethyl acetate extract of trogopterus dung showed outstanding inhibition ratio, under 25 mg/ml condition, the ratio came to 60.06% and 57.81%. Volatile oil of trogopterus dung also showed inhibition activity, but was not significant. Both gingseng and trogopterus dung ethanol ex

16、tract were able to inhibit colibacillus and staphylococcus aureus, while trogopterus dung group performed stronger. Proportion 5:1 came to the highest inhibition ratio at concentration of 25 mg/ml, the ratio was 73.55% and 60.58%, which was significant difference to the blank, that was even higher t

17、han single trogopterus dung.Our study manifested the following results: Compatibility of the tow medicines, affected content of some saponin in ginseng, and enhanced activity components in trogopterus dung. As proportion of panax ginseng went higher, activity of antioxidation and bacteriostasis decl

18、ined, but some of them performed stronger. This indicates that, compatibility of trogopterus dung and panax ginseng is feasible in clinical use for treatment of trogopterus dung-treating diseases.Key word：Trogopterus dung，Panax ginseng，Chemical studies ，compatibility，antioxidation activity，Bacterios

19、tatic studyIV目 录第一章 前言81.1 五灵脂与人参配伍研究概况81.2 五灵脂研究概况121.3 人参研究概况15第二章 五灵脂、人参化学成分研究182.1 五灵脂的化学成分研究182.2 人参的化学成分研究27第三章 五灵脂与人参配伍化学成分变化研究303.1 五灵脂与人参配伍中总黄酮的含量变化研究303.2 五灵脂与人参配伍的原儿茶酸含量变化研究343.3 人参与五灵脂配伍中总皂苷的含量变化研究413.4 人参与五灵脂配伍中9个人参皂苷单体的含量变化研究44第四章 DPPH法体外抗氧化活性研究524.1 清除DPPH自由基的原理534.2 实验材料、仪器及试剂534.4 结

20、果与讨论55第五章 体外抑菌活性研究595.1 实验材料、仪器及试剂595.2 实验方法605.3 实验结果625.4 结果与讨论71第六章 结论73参考文献76I致谢79作者简介80插图清单图1-1 复齿鼯鼠及五灵脂13图2-1 五灵脂提取流程图20图2-2 五灵脂脂溶性成分总离子流色谱图22图2-3 人参总皂苷提取流程图28图3-1 芦丁标准曲线示意图32图3-2 总黄酮含量变化趋势示意图33图3-3 原儿茶酸标准曲线示意图36图3-4 原儿茶酸标准品HPLC36图3-5 单味五灵脂HPLC38图3-6 五灵脂与人参配伍5:1HPLC38图3-7 五灵脂与人参配伍3:1HPLC39图3-8

21、 五灵脂与人参配伍1:1HPLC39图3-9 五灵脂与人参配伍1:3HPLC39图3-10 原儿茶酸含量变化趋势示意图40图3-11 人参皂苷Re含量变化趋势示意图42图3-12 总皂苷含量变化趋势图示意图44图3-13 人参皂苷标准品HPLC检测结果45图3-14 单味人参HPLC46图3-15 五灵脂与人参配伍1:3HPLC46图3-16 五灵脂与人参配伍1:1HPLC46图3-17 五灵脂与人参配伍3:1HPLC46图3-18 五灵脂与人参配伍5:1HPLC46图3-19 人参皂苷Rb1、Rb2、Rf、Rg1、Rg2含量变化趋势49图3-20 人参皂苷Rb3含量变化趋势49图3-21 人

22、参皂苷Rc、Rd含量变化趋势50图3-22 人参皂苷Re含量变化趋势50图4-1五灵脂各层提取物清除DPPH活性56图4-2五灵脂与人参配伍的醇提物清除DPPH活性57图4-3五灵脂挥发油清除DPPH活性58表格清单表2-1 五灵脂脂肪酸成分组分及相对含量23表2-2 五灵脂非脂肪酸成分组分及相对含量24表3-1 样品称量32表3-2 五灵脂、五灵脂和人参配伍的总黄酮含量34表3-3 样品称量35表3-4 原儿茶酸标准曲线数据36表3-5 对照品的精密度（n=3）37表3-6 重现性实验结果37表3-7 稳定性实验结果37表3-8 加样回收率测定结果38表3-9 含量测定结果40表3-10 人

23、参、五灵脂和人参配伍的总皂苷含量43表3-11 样品称量45表3-12 人参皂苷检测的色谱条件45表3-13 含量测定结果48表4-1五灵脂各层提取物清除DPPH活性55表4-2五灵脂与人参配伍的醇提物清除DPPH活性56表4-3五灵脂挥发油清除DPPH活性57表5-1不同阳性药的抑菌圈直径(mm)62表5-2五灵脂石油醚提取物的抑菌作用（n=3）63表5-3 五灵脂氯仿提取物的抑菌作用（n=3）63表5-4 五灵脂乙酸乙酯提取物的抑菌作用（n=3）64表5-5 五灵脂正丁醇提取物的抑菌作用（n=3）65表5-6 五灵脂挥发油的抑菌作用（n=3）66表5-7 五灵脂醇提物的抑菌作用（n=3）6

24、6表5-8 五灵脂与人参（5:1）配伍后醇提物的抑菌作用（n=3）67表5-9 五灵脂与人参（3:1）配伍后醇提物的抑菌作用（n=3）68表5-10 五灵脂与人参（1:1）配伍后醇提物的抑菌作用（n=3）69表5-11 五灵脂与人参（1:3）配伍后醇提物的抑菌作用（n=3）69表5-12 人参醇提物的抑菌作用（n=3）70吉林农业大学硕士学位论文 五灵脂与人参配伍化学成分及体外药理活性变化研究第一章 前言1.1 五灵脂与人参配伍研究概况1.1.1 五灵脂与人参配伍的文献研究中药十九畏是中药药性理论的重要组成部分，其是否为临床配伍禁忌，从古至今都颇有争议。而本文研究的五灵脂与人参正是中药十九畏中

25、临床应用较多的一对配伍，对其进行实验研究，可为临床合理配伍提供科学有效的重要依据。参考李德全1的五灵脂与人参配伍的方剂统计分析结果，得知五灵脂与人参配伍共用的古今方剂共47首。其中以五灵脂功效、主治为主的方剂有34首，以人参功效、主治为主的方剂有8首，以二者功效并重的有5首。1.1.1.1 以五灵脂功效、主治为主的方剂有：1.化癥回生片：五灵脂（醋炙）14g，人参42g。处方来源：中国药典（2000年版）。2.七珍散：五灵脂5钱，人参5钱。处方来源：玉案卷五。3.人参川芎汤：五灵脂1分，人参1分。处方来源：医碥卷六。4.马兜铃散：五灵脂1两，人参1两。处方来源：圣惠卷四十六。5.乌蛇丸：五灵脂

26、（炒）1两，人参1两。处方来源：圣济总录卷十一。6.五灵脂汤：五灵脂1两，人参半两。处方来源：圣济总录卷六十五。7.五灵脂汤：五灵脂5分，人参8分，。处方来源：女科玉尺卷四。8.五灵脂散：五灵脂杏核大，人参1钱。处方来源：鸡峰卷二十。9.全生锭：五灵脂（水飞）2钱半，人参2钱半。处方来源：诚书卷八。10.化癥回生丹：五灵脂2两，人参6两。处方来源：温病条辨卷一。11.太一神应丹：五灵脂1分，人参2分半。处方来源：秘传外科方。12.牛黄搜风丸：五灵脂1两，人参3两。处方来源：疡医大全卷二十八。13.世秘资生丹：五灵脂（醋浸，瓦焙）5钱，人参5钱。处方来源：宁坤秘籍卷上。14.仙传一块气丸：五灵脂

27、1钱1字，人参1钱1字。处方来源：医学入门卷七。15.白虎丸：五灵脂3两，人参3两。处方来源：普济方卷九十三。16.产宝丸：五灵脂（醋炒）5钱，人参（炒）5钱。处方来源：奇方类编卷下。17.产后丸：五灵脂5钱，人参3钱。处方来源：全国中药成药处方集（南京方）。18.安胃散：五灵脂（以醋和面裹，烧令香熟去面）杏核大，人参1分。处方来源：普济方卷三十六引指南方。19.妇科回生丹：五灵脂（醋炒）5钱，人参（去芦）3钱。处方来源：全国中药成药处方集（天津方）。20.朱砂丸：五灵脂半两，人参1分。处方来源：圣惠卷八十二。21.返元汤：五灵脂钱半，人参5分。处方来源：简明医彀卷七。22.定坤丹：五灵脂（醋

28、炒）5钱，人参（去芦）5两，。处方来源：北京市中药成方选集。23.狐肝丸：五灵脂1两，人参1两半。处方来源：圣济总录卷六。24.绎皮丸：五灵脂2两，人参2两。处方来源：朱氏集验方卷十。25.转治汤：五灵脂2钱，人参5钱。处方来源：辨证录卷三。26.保和锭子：五灵脂5分，人参2钱半。处方来源：万氏家抄方卷五引钱氏方。27.神仙秘宝丹：五灵脂（炒）8钱，人参（去芦）半两。处方来源：杨氏家藏方卷一。28.胡黄连丸：五灵脂半两，人参半两。处方来源：圣济总录卷一七七。29.消癖丸：五灵脂1钱，人参3分。处方来源：普济方卷三九一。30.琥珀人参丸：五灵脂1两，人参1两。处方来源：张氏医通卷十三。31.紫金

29、锭子：五灵脂5分，人参2钱半。处方来源：古今医鉴卷十三。32.散血消肿汤：五灵脂5分，人参7分。处方来源医学入门卷七。33.集圣丸：五灵脂（炒）2钱，人参3钱。处方来源：幼幼集成卷三。1.1.1.2 以人参功效、主治为主的方剂有：1.乌附苁蓉丸：人参半两，五灵脂半两。处方来源：普济方卷二四三。2.长生聚宝丹：人参（去芦）2两，五灵脂1两。处方来源：医方类聚卷一五三引经验秘方。3.回生丹：人参9g，五灵脂15g。处方来源：金鉴卷四十八。4.补阳固代长生延寿丹：人参7钱，五灵脂5钱。处方来源：中国医学大辞典引彭祖方。5.豆蔻藿香汤：人参1两，五灵脂1两半。处方来源：医方类聚卷八十九引施圆端效方。6

30、.固本暖脐膏药：人参5钱，五灵脂5钱。处方来源：活人方卷二。7.彭祖固阳固蒂长生延寿丹：人参7钱，五灵脂5钱。处方来源：医学入门卷一。8.蒸脐秘妙方：人参7钱，五灵脂5钱。处方来源：遵生八笺卷十八。1.1.1.3 以二者功效并重的方剂有：1.益气活血汤：人参10g，五灵脂 10g。处方来源：福建中医药1993,24（5）：132.八珍加味汤：人参3钱，五灵脂3钱。处方来源：医中一得。3.华山五子丹：人参2两，五灵脂2两。处方来源：医方类聚卷八十九引施圆端效方。4.灵砂丹：人参（去芦）半两，五灵脂1分。处方来源：幼幼新书卷二十三引医方妙选。5.参脂四物汤：人参2钱，五灵脂（微焙，研末，酒飞，去砂

31、）2钱。处方来源：医林纂要卷八。1.1.1.4 讨论：人参从古至今一直作为重要药物，在各方面应用的都比较多，尤其在抗衰老方面应用较多。但是从上边内容分析可知，在五灵脂和人参配伍应用的方剂中大多数是以五灵脂的主治功效为主的，多用于胃痛瘀血症和妇科瘀血症，二者配伍后虽然也有用于抗衰老的治疗，但数量较少，只有2-3首，这一点与人参大量在抗衰老方剂中应用这一现象很不相称，是否提示：五灵脂与人参配伍后，五灵脂使人参在抗衰老方面的作用丧失了？人参又是否使五灵脂的在某些方面的作用增强了？国内在对五灵脂与人参配伍后的很多方面都进行了实验研究，多数是对人参部分活性成分变化进行研究，但从文献分析来看，五灵脂与人参

32、配伍，多数是以五灵脂功效、主治为主，但目前对五灵脂与人参配伍后五灵脂活性成分含量变化方面尚缺乏研究来证实，因此，本论文以此作为深入研究的方向之一。1.1.2 五灵脂与人参配伍化学实验研究进展近年来，有很多学者从药理、临床方面对五灵脂与人参的配伍进行了研究，研究结果存在分歧。有人认为五灵脂与人参配伍可以增强疗效2-3，有人认为人参中加入五灵脂降低了药效4-5。张旭等人从化学方面，对五灵脂与人参的配伍实质，采用液质联用技术，对其配伍前后的人参皂苷的变化进行了比较系统的研究。而此次实验结果表明，使用液质联用技术可以快速的鉴定五灵脂与人参的配伍溶液、药渣和沉淀中人参皂苷的含量变化。五灵脂的加入，可以使

33、溶液中人参皂苷的总量趋于减少，但五灵脂加入量不同对人参中各单体皂苷的影响各不相同，五灵脂的加入，使部分人参皂苷生成沉淀。李德全1也对人参与五灵脂配伍进行了实验研究，用薄层色谱法定性研究有效成分，用紫外分光光度法和高效液相法对人参和五灵脂配伍后成分进行定量分析，实验结果表明，人参与五灵脂合用后，使人参总皂苷和人参皂苷Rg1，Rb1，Re的含量降低，而作者认为含量降低的程度与煎煮方式以及两种药物的用量比例有关。国内在对五灵脂与人参配伍后的化学方面进行的实验研究，多数是针对人参部分活性成分变化进行研究，到目前为止对五灵脂与人参配伍后五灵脂活性成分含量变化方面尚缺乏研究来证实，因此，本论文以此作为深入

34、研究的方向之一。1.1.3 五灵脂与人参配伍药理实验研究进展1.1.3.1 毒性作用在现代药理学实验中，五灵脂与人参配伍，从小白鼠急性毒性实验证明，二者合用毒性较小。例如：小鼠急性毒性实验表明6，人参与五灵脂配伍，口服不具毒性，但腹腔注射毒性呈增加趋势；而大鼠的亚急性毒性实验显示，五灵脂与人参配伍并不影响大鼠的血小板数，白细胞数量和血红蛋白含量及体重。对大白鼠肝、肾功能的检测，能说明五灵脂与人参共用至少不会增加正常动物肝、肾的损害, 相反对肝、肾功能还可能有改善作用。1.1.3.2 免疫实验鲁耀邦7等人通过对人参与五灵脂1:1配伍后，正常小鼠免疫功能研究的实验证明了，人参与五灵脂配伍组与人参、

35、五灵脂单煎液组比较，对正常小鼠单核吞噬细胞系统吞噬功能、免疫器官发育、溶血素抗体形成，均有显著增强的作用，但各组比较并无显著差异，即人参与五灵脂配伍后，未使免疫功能降低。郭国华8等的研究表明，人参、五灵脂配伍具有一定的抗免疫抑制剂降低WBC的作用，对正常生理及免疫功能低下的小鼠，当人参剂量等于或小于五灵脂时，对小鼠的白细胞、红细胞及肾上腺等指数影响不显著，使骨髓有核细胞数显著降低。但当人参剂量大于五灵脂剂量时，可使上述指标显著升高8。因此认为在免疫效应方面，五灵脂基本上不影响人参的作用，相畏现象不明显。毛晓健9等报道了在环磷酰胺（CPA）造成小鼠免疫功能抑制条件下及正常条件下，人参，五灵脂不同

36、比例配伍前后对小鼠骨髓中血中红细胞，有核细胞数，白细胞数，免疫器官重量，凝血时间等影响的研究成果，即人参能增加CPA作用下骨髓中有核细胞数，五灵脂及五灵脂与人参的配伍组的影响不明显。在CPA及正常条件下，人参组及五灵脂与人参配伍组均能增加血中白细胞数，红细胞数及免疫器官的重量，得到结论五灵脂对上述指标影响不明显，但能延长凝血时间(正常小鼠)，且五灵脂与人参配伍后比用单味时效果更明显9。1.1.3.3 抗应激实验 有报道认为，五灵脂可降低人参的抗耐缺氧作用和抗疲劳作用8，还有报道称人参，五灵脂及其配伍组，均能明显提高正常小鼠耐缺氧、耐疲劳、耐寒、耐高温的能力，且上述作用在配伍组与单味药组中均无显

37、著性差异10。因此认为五灵脂对人参抗应激作用无明显影响。有实验证明五灵脂与人参配伍并用，对小鼠艾氏腹水癌细胞（EBC）扩散有抑制作用，能延长荷瘤小鼠的存活期，且效果明显优于单味人参。 郭国华等11观察了人参与五灵脂配伍对小鼠四氯化碳肝损伤影响，实验表明：人参与五灵脂配伍对四氯化碳造成的急性肝损伤小鼠有保护作用。目前为止，国内对五灵脂与人参配伍的药理实验方面研究多数是针对以人参功效、主治为主的方面进行药理研究，但从文献分析来看，五灵脂与人参配伍，多数是以五灵脂功效、主治为主，所以，本论文将对此进行研究。1.1.4 五灵脂与人参配伍临床研究进展我国古代医学家对五灵脂与人参配伍能不能应用于临床早有争

38、议，支持者有之，反对者也不少。五灵脂与人参并用在临床自古就有，且应用较多，疗效显著。如李时珍的父亲李言闻曾指出：“古方疗月闭，四物汤加人参、五灵脂，是畏而不畏也。”12张氏医通中治疗血蛊的琥珀人参丸：“此人参与五灵脂并用，最能浚血。血在隔膜之上，非五灵脂无以浚之。”显然，五灵脂善通瘀血，与人参并用则效力更佳。常敏毅13在临床上治疗肝癌、肝硬化及腹腔肿瘤时，常在抗癌中草药中家红参3g，五灵脂15g，使用多年，并未见有1例发生毒副反应，且大多数症状均有改善。五灵脂与人参两者并用，在临床上已用于冠心病、胃溃疡、疳积12、神经性头痛、胃癌、慢性胆囊炎、结核性胸膜炎、再生障碍性贫血、风湿性心脏病、急性风

39、湿病等病症，并且都有较好的疗效。这些论述有力的说明了，五灵脂与人参配伍是可以应用于临床的，且具有重要的医疗价值，值得深入研究。1.2 五灵脂研究概况五灵脂为脊索动物门，哺乳纲，鼯鼠科（Petauristidae），复齿鼯鼠（Trogopterus xanthipes Milne-Edwards）的干燥粪便，主产于山西、河北等省，及北京市郊，湖北，四川等省亦有少量饲养，全年均可在岩洞或石缝周围寻找收集14。图1-1 复齿鼯鼠及五灵脂 Pig1-1 Trogopterus xanthipes Milne-Edwards and Faeces Trogopterori1.2.1 五灵脂的考证与分布1

40、.2.1.1 五灵脂的基原考证五灵脂这味药材最早记载于宋开宝6-7年，刘翰马志等编著的开宝本草15，五灵脂，味甘，温，无毒。主疗心腹冷气，小儿五疳，辟疫，治肠风，通利气脉，女子月闭。出北地，此是寒号虫粪也。”据李时珍的本草纲目记载：“鹖鴠乃侯时之鸟也，五台诸山甚多，其状如小鸡，四足有肉翅，夏月毛采五色，自鸣若曰：凤凰不如我。至冬毛落如鸡雏，忍寒而号曰：得过且过。其屎恒集一处，气甚腥恶，粒大如豆，采之有如糊者，有粘块如糖者。人亦以沙石杂而货之。凡用糖心润泽者为真。”16李时珍已经在本草纲目中把五灵脂的原动物形态、习性、分布，以及药材形状、气味、真伪优劣都形象的描述的一清二楚了，为后人提供详尽的文

41、献记载，有重要参考价值。从宋朝起到现在，对五灵脂的原动物品种，众说纷纭。最后在1979年的中国药物动物志中，将橙足鼯鼠更名为复齿鼯鼠。从1990版中国药典起，也将五灵脂的原动物正式确定为复齿鼯鼠17。但由于五灵脂为动物粪便，随意性较大，稳定性较差，1995版药典又将其取消。1.2.1.2 五灵脂的分布及产量情况分析五灵脂古代盛产于华北、华中和西部山区。现主产于陕西、甘肃、河南、河北、湖北、山西等地。野生的从岩洞中掏取后，拣去杂质，晒干。分布于陕西、山西、湖南、湖北产区的五灵脂，其产量占全国的70%左右。目前，野生品种较分散不易收集，因此能提供的量较少，且不稳定。目前陕西商洛地区主要以家笼养殖为

42、主，但发展缓慢，家养品种核较大，野生品种质坚体小，产量甚少。湖南、湖北、山西产区主要以野生为主，不易收集，导致产量较少。五灵脂一直处于“僧多粥少”情况。家笼养殖主要的商品是皮毛，五灵脂只不过是副产品，产量无法大增。随着野生复齿鼯鼠资源的减少，以及皮毛用量的增加，将会导致能提供的五灵脂产量越来越少。随着劳动价值的提升，采集的人减少且采收难度增大，导致货源越来越少。2004年下半年以来，随着供需矛盾的加剧，产地开始出现掺杂造假现象，使质量大大下降。 未来应在兼顾药用的同时，加强保护五灵脂资源的可持续利用。1.2.2 五灵脂的化学成分研究五灵脂中主要含有三萜类化合物，含氮化合物，酚酸类，简单单萜类，

43、二萜酸类，维生素样物质、树脂和无机盐等。1.2.2.1 三萜类化合物三萜类化合物多具有抑菌、抗炎和溶血活性。日本学者Atsushi Numata（篤沼田）等发现18-19，五灵脂含有托马酸-3-氧-顺-对香豆酸脂（3-O-cis-p-coumaroyltormentic acid），托马酸（toumentic acid），托马酸-3-氧-反-对香豆酸脂（3-O-trans-p-coumaroyltormentic acid），坡膜醇酸（pomolic acid），马斯里酸（amslinic acid），马斯里酸-3-氧-反-对-香豆酸脂（3-O-trans-p-coumaroylmas-lin

44、ic acid），2a-羟基乌苏酸（2a-hydroxy ursolic acid），加可酸（jaco-umaric acid），乌苏酸（ursolic acid），欧斯咖啡酸（euscaphic acid）。后又有报道20-21从中分离得到三对节酸（serratagenic acid），五灵脂三萜酸（goreishic acid）、。1.2.2.2 含氮类化合物含氮类化合物多为复齿鼯鼠的体内代谢终产物，尿素局部用药可以使皮肤软化，防止手足皲裂和冻疮。L-酪氨酸医药上多用作治疗甲状腺功能亢进。杨东明等人22从五灵脂中分离得到：尿嘧淀（urcil），次黄嘌呤（hypoxanthing），尿囊素（

45、allantoin），L-酷氨酸（L-tyrosine），尿素（urea），尿酸（uric acid）。1.2.2.3 酚酸类化合物 酚酸类化合物在抑菌、抗炎、镇痛、抗血小板凝集方面，有较强活性。 仲崇林、朴淑敏、杨东明等人22-24从五灵脂中得到邻苯二酚、原儿茶酸（protocatechuic acid），五灵脂二萜酸（wulingzhic acid），焦性儿茶酚（pyrocatechol），苯甲酸（benzoic acid），间羟基苯甲酸（m-hydroxybenzoic acid），3-蒈烯-9，10-二羧酸（3-caren-9，10-dicarboxylic acid），5-甲氧基-7

46、-羟基香豆素（5-methoxy-7-hydroxycoumarin）。1.2.2.4 微量元素陈月开25等人经研究发现，五灵脂中含有钙、铁、锌、镁、锰、铜、钠、铬、钼、钴、镍、锶、镉等，还含有少量的铝。刘文粢26等人通过对五灵脂生药及其炮制品的微量元素含量测定，发现五灵脂经过炮制后可减少铝的溶出量，从而减少生药的毒性。1.2.2.5 挥发性成分 魏垠等人27通过研究发现五灵脂中含有的挥发性成分主要为：醇类（10种），酮类（8种），醛类（6种），烯类（5种），酸类（4种），酚类（4种）。 五灵脂挥发性成分中的醇、酮、醛类化合物多数具有杀菌、消炎、抗氧化等作用五灵脂挥发性成分中含有大量醇、酮、醛

47、类化合物28。1.2.2.6 其他成分 李强等人29还发现五灵脂中含有正二十七烷、维生素类和树脂等物质。1.2.3 五灵脂的药理作用及临床应用研究1.2.3.1 五灵脂的药理作用研究现代药理学研究证明，五灵脂具有抗血小板凝聚、促进纤维蛋白溶解、抗炎、抗溃疡、抑菌、抗病毒、提高免疫力以及清除自由基等多方面作用30。为了进一步研究五灵脂与人参配伍的化学变化，所以对五灵脂也进行了化学成分研究，以期从中找到有活性的天然产物，为其药理研究奠定基础，也为分析人参五灵脂配伍禁忌打下物质基础。1.2.3.2 五灵脂的临床应用研究五灵脂在复方中应用较多，在活血化瘀的方剂中应用广泛。1.治疗毒蛇咬伤，1965年江

48、苏省中医杂志，共治疗10例，皆痊愈。2.治疗过敏性紫癜，1987年新中医，治疗22例，治愈18例，显效4例。3.治疗心脑血管疾病，血栓所致的偏瘫，3日四肢转暖，15日后患肢基本恢复，并能下床活动。4.在妇科疾病中用于治疗原发性痛经，1991年安徽中医学院学报，治疗25例，显效15例，有效8例，无效2例。用于治疗子宫内膜异位31-32，治疗30例，痊愈12例，显效16例，无效2例。5.治疗急性痛症33，554例，显效194例，有效298例，无效62例。张春澜34等人用来治疗血管性头痛，34例，且疗效满意。6.治疗溃疡，李庆明等人35用五灵脂治疗十二指肠溃疡，得到了91.18%的总有效率，及70.

49、79%的痊愈率，疗效显著，无毒副作用。1.3 人参研究概况人参(Panax Ginseng C.A.Meyer)是五加科多年生草本植物，也是长白山区盛产的道地药材之一，以干燥根入药。神农本草经记载其具有“补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目开心益智，久服轻身延年。36”等良好作用，是一种名贵的中药材。经研究证实，人参中含有人参皂苷、人参多糖、人参挥发油等有效成分。其中人参皂苷是人参的主要有效成分，现已明确的人参皂苷单体约有40余种，而不同的人参皂苷也具有不同的药理活性。现代医学普遍认为，人参对心血管系统，中枢神经系统，消化系统，免疫系统，内分泌系统，泌尿生殖系统都具有广泛作用，从而可以

50、提高人体的智力及体力，增强机体对有害刺激的非特异性抵抗力。人参的药理活性，常常因机体机能状态不同而产生双向作用，因此说人参是具有“适应原”作用的典型代表。 1.3.1 人参皂苷的研究1.3.1.1 人参皂苷Rb1性质：白色粉末（乙醇-正丁醇）。熔点197198。旋光度+12.42（c=0.91，甲醇）。药理活性：人参皂苷Rb1对心律失常、心肌细胞膜离子通道病变、心肌细胞受体异常、自主神经功能紊乱、心肌细胞凋亡有较好的作用。人参皂苷Rb1对大脑有一定的抑制作用，能改善记忆的获得和再现，还具有促进智力发育与抗老年痴呆的作用，同时还具有促性强精的作用，人参皂苷Rb1在机体内代谢的产物还具有一定的抗癌

51、活性37。人参皂苷Rb1不仅具有抑制细胞质过氧化反应，具有清除自由基的能力，还可以使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性增强38。Rb1还可以明显提高体外培养神经元的活力，具有促进周围神经轴突生长作用39。1.3.1.2 人参皂苷Rb2性质：白色粉末（甲醇-正丁醇）。熔点200203，198201（分解）。旋光度+3.05（c=0.98，甲醇）药理活性：人参皂苷Rb2可中等程度抑制猫的行为和脑电，并抑制电刺激猫所引起的脑电觉醒反应。对大鼠有减慢心率和先微微升高后下降的双向性血压作用，还能舒张大血管，有一定的溶血作用40。人参皂苷Rb2能明显增加大鼠骨髓细胞中DNA和蛋白质的合成，并且能促进血清蛋

52、白合成。还有明显的抗疲劳作用，可明显增加小鼠被强迫行走后的自发活动。1.3.1.3 人参皂苷Rb3性质：白色粉末（甲醇-正丁醇）。熔点193195。旋光度+19.4（c=1，甲醇）。药理活性：人参皂苷Rb3具有改善神经功能缺损，缩小脑内梗死面积，缓解脑水肿的作用。还对大鼠局灶性脑缺血损伤有保护作用41。1.3.1.4 人参皂苷Rc性质：白色粉末（乙醇-正丁醇）。熔点192194（分解），199201。旋光度+1.93（c=1.03，甲醇）。药理活性：人参皂苷Rc对BaCl2引起的大鼠心律不齐有一定抵抗作用；对血压有双向性作用；抗疲劳；钙拮抗；促进皮质酮血浆分泌。1.3.1.5 人参皂苷Rd性质

53、：白色晶体粉末（乙醇-乙酸乙酯）。熔点206209，旋光度+19.38（c=1.03，甲醇）。药理活性：人参皂苷Rd可使乙酰胆碱引起的肠管收缩减弱；对大鼠有减慢心率和双向性血压作用作用（先升后降）；能促进血清蛋白质合成；还可使14C-醋酸盐掺入大鼠血清和肝中胆固醇的量增加；也具有抗疲劳作用，能明显增加小鼠被迫行走的自发活动40。1.3.1.6 人参皂苷Re性质：无色针状晶体（50%乙醇）。熔点201203。旋光度0-1.00（c=1.00，甲醇）。药理活性：人参皂苷Re对帕金森症小鼠有保护作用，可明显提高体外培养神经元的活力，有促进周围神经轴突生长的作用，还能显著对抗自然衰老引起的极易获得障碍

54、，对麻醉大鼠海马齿状回基础突出传递有增强作用，且能形成突触长时程增强形象。人参皂苷Re能有效改善大鼠学习记忆障碍的作用42。1.3.1.7 人参皂苷Rf性质：白色粉末（丙酮）。熔点197198，旋光度+6.99 （c=1.00，甲醇）。o-甲基化人参皂苷Rf为丛晶（已烷），熔点171，旋光度+0.30 （c=0.99，氯仿）。 无色针状晶体（50%乙醇）。熔点201203。旋光度0-1.00（c=1.00，甲醇）。药理活性：目前，对人参皂苷Rf的药理活性研究较少。1.3.1.8 人参皂苷Rg1性质：结晶性粉末（正丁醇-甲基乙基酮或甲酸乙酯）。熔点194196.5，旋光度+32 （吡啶）。旋光度

55、D+24.80 。溶于甲醇、吡啶、热丙酮，稍溶于乙酸乙酯及氯仿。其乙酰化物溶于甲醇、吡啶、热丙酮，稍溶于乙酸乙酯及氯仿。其乙酰化物为针晶，熔点245。药理活性：人参皂苷Rg1 有益于增强学习和记忆能力的作用，还能调节体温，抗脂质过氧化，能促进蛋白质合成，选择性增强大鼠的免疫功能，加强机体对有害因素的抵抗力。提高机体的适应性，易化与衰老有关的行为活动和运动反应，降低高钾诱导的海马突出体内游离钙离子的浓度43-45。刘单46，通过开阔实验、斜板实验、爬杆试验、牵引实验观察研究表明Rg1可剂量依赖性地改善老年动物衰退的行为活动功能。研究表明老年动物中枢神经系统内过氧化水平显著增加，自由基及脂质过氧化

56、在衰老过程中起着重要作用。1.3.1.9 人参皂苷Rg2药理活性：人参皂苷Rg2对急性心源性休克有保护作用，具有抗休克、抗心衰、抗凝血、抗血栓作用。主要表现在强壮心肌，增强心肌收缩力，减慢心率，扩张血管，增加心输出量和提高冠脉流量，能快速改善心肌缺血和缺氧，具有明显的增强心功能作用。 人参皂苷Rg2 具有双向调节中枢神经系统的兴奋与抑制过程，影响脑内蛋白质的合成，促进需氧代谢，影响神经递质合成及减少氧自由基的产生等作用，能减少Glu的胞内合成，降低Glu、NR1 和NR2B在神经细胞中的表达，使NMDAR亲和力下降，减少Glu与NMDAR的结合，降低其兴奋毒性，减少Ca2+的内流，保护神经细胞

57、41，从而具有改善学习记忆的作用，其更详细机制尚需深入探讨。 第二章 五灵脂、人参化学成分研究2.1 五灵脂的化学成分研究五灵脂为脊索动物门，哺乳纲，鼯鼠科（Petauristidae），复齿鼯鼠（Trogopterus xanthipes Milne-Edwards）的干燥粪便，主产于山西、河北等省，及北京市郊，湖北，四川等省亦有少量饲养，全年均可在岩洞或石缝周围寻找收集47。五灵脂主要有效成分为五灵脂酸（wulingzhic acid），为异海松酸的衍生物；并含有原儿茶酸（protocatechuic acid），焦性儿茶酚（pyrocatechol），苯甲酸（benzoic acid），

58、间羟基苯甲酸（m-hydroxybenzoic acid），五灵脂三萜酸（goreishic acid）、，3-蒈烯-9，10-二羧酸（3-caren-9，10-dicarboxylic acid），尿嘧淀（urcil），次黄嘌呤（hypoxanthing），尿囊素（allantoin），L-酷氨酸（L-tyrosine），3-O-顺-对-香豆酰委陵菜酸（3-O-cis-p-coumaroyltormentic acid），3-O-反对-香豆酰委陵菜酸（3-O-trans-p-coumaroyltormentic acid），坡模醇酸（pomolic acid），2-羟基熊黑酸（2-hydro

59、xyursolic acid），高加蓝花楹三萜酸（jacoumaric acid），3-O-反-对-香豆酰马期里酸（3-O-trans-p-coumaroylmaslinic acid），熊果酸（ursolic acid），委陵菜酸（tormentic acid），野雅椿酸（euscaphic acid），马斯里酸（masolinic acid）；还含三对节萜酸（serratagenic acid），5-甲氧基-7-羟基香豆素（5-methoxy-7-hydroxycoumarin）等48。现代药理研究证明，五灵脂具有抗血小板凝聚、促进纤维蛋白溶解、抗炎、抗溃疡、抑菌、抗病毒、提高免疫力以及清

60、除自由基等多方面作用49。为了进一步研究五灵脂与人参配伍的化学变化，所以对五灵脂也进行了化学成分研究，以期从中找到有活性的天然产物，为其药理研究奠定基础，也为分析人参五灵脂配伍禁忌打下物质基础。2.1.1 五灵脂化学成分的提取分离 从文献了解到48，通过对五灵脂各层粗提物的活性筛选，发现乙酸乙酯部分相对于石油醚部分、氯仿部分和正丁醇部分来说，有较强的活性，对抑菌试验、对抗氧化清除DPPH活性、对体外抗血小板凝聚实验、和在镇痛抗炎实验中，均有较好效果。所以本实验主要对乙酸乙酯部分进行了化学分离研究。2.1.1.1 实验材料、仪器及试剂实验材料本实验使用的五灵脂样品，于2009年6月份购自吉林省同

61、仁堂大药店，经吉林农业大学中药材学院张连学教授鉴定为正品五灵脂。实验仪器HH-6B 数显恒温水浴锅RE-52AA旋转蒸发仪电子天平予华牌循环水真空泵电磁炉HJ-6型多头磁力加热搅拌器泰特牌上海亚荣生化仪器厂余姚纪铭称重校验设备有限公司河南巩义市英峪予华仪器厂美的电磁炉江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司蒸馏水乙醇（分析纯A.R）石油醚（分析纯A.R）三氯甲烷（分析纯A.R）乙酸乙酯（分析纯A.R）正丁醇（分析纯A.R）丙酮（分析纯A.R）甲醇（分析纯A.R）薄层层析硅胶（化学纯G）羧甲基纤维素钠（分析纯A.R）柱层层析硅胶（试剂级）吉林农业大学蒸馏水室北京化工厂天津天泰精细化学品有限公司北京化工厂北京化工厂北京化工厂北京化工厂北京化工厂青岛海洋化工有限公司天津市光复精细化工研究所青岛海洋化工有限公司实验试剂2.1.1.2 提取 图2-1 五灵脂提取流程图 Fig.2-1 Faeces Trogopterpri extract Flow Chat 采用水提醇沉法，取干燥五灵脂加入8倍量的蒸馏水浸泡45min，沸水煮提3次，每次2小时。提取液经双层白绸子过滤后，合并滤液，加热浓缩。向浓缩液中加