流式细胞术免疫标记简介.ppt

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1、流式细胞术免疫标记应用简介,2009-12-03,流式细胞术系列讲座之免疫标记,上次流式细胞术讲座内容（概述）,流式细胞术的一般介绍 流式细胞术在临床检测和科研中的应用,流式细胞仪可检测的细胞参数,细胞结构 细胞大小 细胞颗粒性程度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量,细胞功能 细胞表面蛋白抗原 细胞胞浆内蛋白性抗原 细胞内细胞因子 细胞增殖 细胞内钙离子浓度,免疫标记技术,免疫标记技术（immunolabelling technique）:是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 流式细胞术检测蛋白质分子：免疫

2、荧光标记技术,FACSCalibur流式细胞仪能够检测的荧光（Fluorescence）信号,FL1 （第一荧光） -FITC(异硫氰酸荧光素） FL2 （第二荧光） -PE（藻红蛋白） FL3 （第三荧光） -PerCP, PeCy5等 PL4 （第四荧光） -APC（藻青蛋白）,双色直接染色,流式细胞术免疫荧光标记的应用,检测细胞表面蛋白抗原 检测细胞胞浆内蛋白性抗原 检测细胞内细胞因子 优势：在同一细胞上同时检测多种标志,血液系统各型细胞免疫标志,CD34+抗原在早期造血祖细胞内呈高水平表达，随着细胞成熟其表达呈进化性下降，继而消失。 CD38抗原是造血干细胞向多系定向分化的标志之一，并

3、随一定的分化过程表达上调 最近发现CD90（Thy-1）是比CD34更早的干、祖细胞标志 结合多种分化抗原的表达可以作为造血细胞不同发育阶段的标志。 如CD34+、CD33+细胞群为多能干细胞向髓系定向的标志； CD34+、CD19+多为多能干细胞向B系定向的祖细胞。 CD34+、TdT+、CD10+、CD7+则被认为是向T系定向的祖细胞。,造祖/干细胞,T细胞及其亚群 T祖细胞（pro-T）的表型为CD34+、TdT+、CD10+、CD7+ 未成熟T细胞标志CD3、CD4和CD8。 在T细胞发育过程中，CD7是最早出现的T细胞标志，且贯穿表达在整个T细胞分化发育过程中。 胸腺细胞要分化发育为

4、有功能的成熟T细胞，细胞表面标志需经历一定的变化过程。,T细胞标志,进入外周淋巴器官和血液，执行免疫功能,CD7+、CD2-、CD3-、CD4-、CD8-、TCR-,CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8-、TCR- （即CD4、CD8双阴性）,CD7+、CD1+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、TCR+ （即CD4、CD8双阳性）,CD7+、CD2+、CD3+、CD4+、CD8-、TCR+,CD7+、CD2+、CD3+、CD4-、CD8+、TCR+,CD3+、CD4+、CD8-：T辅助/诱导细胞（Th/Ti），占T细胞总数的60%70%； CD3+、CD4-、CD8+：T抑制

5、/杀伤细胞（Ts/Tc） ， 20%30%； CD3+ CD4+ CD8+ ： 1%3%； CD3+ CD4- CD8-：1%10%。 前三种表型细胞的TCR主要为TCR，而CD4- CD8- T细胞主要表达TCR，他们都执行细胞免疫功能。,正常外周血中通常存在的T细胞亚群,CD2是绵羊红细胞受体和淋巴细胞功能相关抗原-2（LFA-2），表达于人95%T细胞、50%70胸腺细胞和大颗粒淋巴细胞（LGLNK）的表面。 CD3是T细胞表面抗原，表达于成熟胸腺细胞、静息和激活的的外周血T细胞，是鉴定T细胞的重要标志，其胞浆和膜CD3是早期和普通型T细胞白血病的主要分型标记。,CD5、CD7是T细胞白

6、血病较特异的标记，也是髓系白血病时最常见的伴随标记。CD45则是白细胞的共同标记抗体 CD25和CD28主要分布于活化T淋巴细胞表面，为活化T淋巴细胞标志。胸腺细胞、静止T细胞、静止B细胞以及NK细胞表面无表达。,末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和II类人类白细胞抗原（HLA-DR）的阳性表达对早期T细胞白血病的诊断有重要价值。 8090和95以上的NK细胞表达CD16和CD56。用CD3-CD16+CD56+可定义NK细胞。,B细胞标记,B细胞 B细胞的分化主要分为B祖细胞、前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞6个阶段。 （1）B祖细胞（pro-B）：此期最早表达的B细胞特异

7、性抗原是CD19，同时表达CD34、细胞核TdT、HLA-DR、CD40、CyCD22。 （2）前B细胞（pre-B）：CD34和TdT消失，出现CyCD79、CD10、CD20、CD9、CDw78、CD74，c+（胞浆IgM重链）。,（3）未成熟（早期）B细胞（immature B cell）：CD9、CD10消失，出现 SIgM、CD22。CD20、CD24、CD40、CD72、CD74、CDw78、CD79表达增加。其他新的B抗原CD37、CD2、CDw75、CDw76相继出现。 （4）成熟B细胞（mature B cell）：SIgM和IgD同时表达，并出现CR、FcR和丝裂原受体，上

8、述B细胞抗原继续存在。,（5）活化B细胞（activated B cell）：成熟B细胞被抗原或丝裂原刺激后，成为活化B细胞，继之增生和分化。在此过程伴随表达B细胞激活抗原CD23、CD77、CD80、CD86和其他激活相关抗原如CD25、CD26、CD30、CD69、CD70、CD71、CD38等。膜结合型Ig逐渐减少，分泌型Ig逐渐增加。 （6）浆细胞（plasma cell）：激活B细胞进一步分化成为产生抗体的浆细胞，这时获得PC-1、PCA-1和CD138浆细胞特异抗原，CD85表达增加，CD38抗原再出现。而SIg和上述B抗原消失。CD79仍可存在于胞质中。,B细胞上的CD抗原分为：

9、 B细胞限制性（特异性）抗原： CD19、CD20、CD21、 CD22、CD77 和CD79， 它们的表达只限于B细胞上，在鉴别细胞系上是十分重要的标志。 B细胞相关性抗原： CD5、CD9、CD10、CD23、CD24、CD37、CD40、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CDw78、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD124和CD139。 B细胞表面的受体SIg，是B细胞特异性识别抗原的受体，也是B细胞重要的特征标志。,CD19、CD20、CD21、CD22和CD24都是B细胞白血病和淋巴瘤最常用的标记抗体。 对中国人而言，CD1

10、9是特异性和敏感性最高的。 CD19是一种早期的、谱系特异的泛B细胞表面抗原，从最早期B细胞前体细胞阶段即表达，持续存在直至B细胞终末阶段 外周血T细胞、单核细胞、粒细胞和血小板表面不表达CD19。,髓系细胞标记,包括CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD36、CD45、CD68、CD41、CD42、CD61、CD63和CD117等。 这些免疫标记种类繁杂，缺乏特异性和敏感性（与淋巴细胞标记抗体相比）。,3.髓系标记 从髓系祖细胞终末分化的成熟细胞（粒细胞、单核细胞、血小板和红细胞）间各阶段细胞特征性标志还不十分清楚。 根据粒细胞和单核细胞上的髓系抗原表达试将其大致分为七种类

11、型 : （1）粒细胞和单核细胞上都有较强表达的抗原有：CD13、CDw17、CD32、CD87、CD88、CD89、CDw92、CD93、CD156、CD157、CD163。其中CD13在原粒细胞质中表达比膜上早，在AML诊断上十分重要。 （2）以粒细胞为主，但也存在于单核细胞的抗原有：CD15和CD65。CD65是特异性髓系抗原，强表达在成熟粒细胞，弱表达在单核细胞上。 （3）基本表达在粒细胞上的抗原有：CD16b和CD66。,（4）以单核细胞为主，但也表达在粒细胞的抗原有：CD14和CD33。CD14主要强表达在单核-巨噬细胞，弱表达在粒细胞上。CD33抗原分布只限于造血系统内，表达在髓系

12、祖细胞CFU-GEMM、CFU-GM、CFU-G、CFU-M以及相应的白血病细胞上。 （5）基本只表达在单核细胞上的抗原有：CD16、CD64、CD68、CD91、CDw136和CD65。CD68是目前发现可靠的检测造血系统内单核-巨噬细胞系统的特异标志。,（6）造血干、祖细胞抗原有：CD34和CD90。CD34除表达在早期造血干、祖细胞外，还表达在约40%的AML和60%的ALL上 （7）其他髓系相关抗原：这些抗原主要存在于其他系细胞上，但在某些髓系细胞上也有表达，如：CD4、CD7、CD9、CD10、CD11b、CD11c、CD31、CD36、CD38等。,巨核细胞系 在巨核细胞系发育过程

13、中依次出现PPO、CD41a（b/a）、CD41b（b）和CD61（a）、CD42（b）。还可表达CD36（强）。 正常情况下血小板处于静止状态。目前研制出的抗血小板单抗如CD9、CDw17、CD31、CD36、CD41a、CD41b、CD42a、 CD42b、CD61，主要都针对静止的血小板。 当血小板被激活时，血小板中颗粒内容物释放，整合到活化的血小板质膜内，成为一些激活抗原，如CD62 （P-选择素）、CD63及CD107a和CD107b。 红细胞系 血型糖蛋白A、H。,流式细胞术免疫荧光标记抗体的选择,有特异性标志：选择一种即可，如CD3标记总T细胞； 没有明显的特异性标志：可以采用不

14、同抗体组合，标记某种细胞。如Treg细胞公认的标志为CD4+CD25+FoxP3+. 表面分子标记可以与胞内分子标记相结合； 免疫荧光标记也可以与其它的标记方法相结合：如与CFSE 进行不同细胞亚群增殖分析。,流式细胞术表面分子免疫标记操作举例,淋巴细胞亚群检测操作程序,一、实验原理： 人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。T淋巴细胞表达CD3；B淋巴细胞表达CD19；NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。进面得到各亚群

15、的比例。,二、主要试剂： MultiTEST IMK Kit(美国BD Biosciences公司；CAT:340503)， 其中包括：1、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 2、CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 3、FACSLysing Solution 三、实验操作： 1、标本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞： 标本管编号A，取两只流式专用管A1、A2。 A1管加入CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PreCP/CD19-APC 20uL； A2管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC 20Ul。 A1、A2管中分别再加入全血100Ul，混均。 置室温，避光孵育15min。 加入FACSLysing溶血液2.0ml，置室温，避光孵育10min。 300g离心5min，弃上清液。 PBS洗涤细胞两次，300g离心5min，弃上清液。 1%多聚甲醛0.5mL。 3、上机检测；分析结果；打印实验报告。,流式细胞术胞内分子免疫标记操作流程,流式细胞术胞内分子免疫标记操作举例,B淋巴细胞胞内ZAP-70分子检测操作程序,主要试剂：,【临床意义】,