比色法和分光光度法.ppt

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1、一. 概述 (1) 比色法和可见分光光度法的特点 比色法: 在分析化学中, 利用比较 有色溶液颜色的深浅来测定物质含 量的分析方法称为比色法。过去大 多用眼睛观察比较, 故又称目视比 色法。,第二节 比色法和可见分光光度法,光电比色法(分光光度法): 随着近代分析仪器的发展, 目前已 普遍使用光电比色计(分光光度计)通 过测量有色溶液对入色光的吸收程度 对物质进行分析, 称为光电比色法(分 光光度法)。,与目视比色法相比, 光度法的特点: 灵敏度高;10-5 10-6mol/L 准确度较高; 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； 应用广泛。,(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电

2、磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用波长来描述, 其单位常用纳米(nm)表示, 波长越短, 能量越高。,具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。,互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。,物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。,例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。,吸收

3、曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。,二、朗伯-比尔定律 (1) 朗伯-比尔定律,透光度(透光率T):,吸光度(A):,朗伯-比尔定律:,此式表明: 当一束平行的单色光通 过吸光物质的均匀溶液时, 溶液的吸 光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成 正比。 K:比例常数, 与入射光波长, 溶液 中吸光物质的本性及溶液的温度有 关。,(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用

4、符号a表示, 单位为L/g cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号表示, 单位 为L/ mol cm A=bc a与的关系:,比吸光系数( ): 指质量浓度 为 1%(g/mL), b为1cm时的吸光度 值, 单位为mL/g cm 同一物质的与 之间的关系:,例1 一含Fe2+浓度为0.5mg/L的溶 液, 用邻二氮菲显色测定, 吸收池厚 度为2cm,在508nm处测得吸光度为 0.19, 求其摩尔吸光系数和比吸光系 数。,(3) 偏离朗伯-比尔定律的原因 标准曲线: 根据朗伯-比尔定律,当 吸收池厚度不变, 以吸光度为纵坐 标, 浓度为横坐标作

5、图时, 应得到一 条通过原点的直线, 称为校正曲线或 标准曲线。,偏离朗伯-比尔定律的主要原因: 定律仅适用于稀溶液 化学变化引起的偏离(正偏离) 非单色入射光引起的偏离(负 偏离),三. 方法和仪器 (1) 目视比色法 目视比色法: 用眼睛观察比较溶液颜色深 度以测量物质含量的分析方法称 为目视比色法。,标准系列法的原理:,朗伯-比尔定律对标准系列法原 理的解释: A=sbscs=xbxcx,标准系列法的优点: 仪器简单, 操作简便,适宜于大批 试样分析 适宜于稀溶液中微量组分的测定 某些不完全符合朗伯-比尔定律 的显色反应, 仍可用此法进行测 定。 标准系列法的缺点: 准确度较差。,(2)

6、 光电比色法和可见分光光度法 光电比色法的原理: 所用仪器为光电比色计。 光源滤光片一定波长范围的近似单色光有色溶液透过光光电池检流计的标盘,可见分光光度法所用的仪器称为 分光光度计, 它是利用分光能力很强的 棱镜或光栅的原理, 作为单色器, 可连 续获得不同波长的单色光, 其波长范围 比用滤光片获得的更窄。因此用分光 光度计可连续测量某一定浓度有色溶 液在不同波长下的吸光度, 从而可得其 吸收光谱,通过吸收光谱可选择最适宜 的测定波长。,所以分光光度计采用适当的光源 和检测器, 使测量的范围不只局限于 可见光区。如用红外光作为光源成 为红外分光光度法; 用紫外线作为光 源称为紫外分光光度法。

7、, 光电比色计和可见分光光度计的 基本部件,a. 光源 要求: 光源须具有足够的辐射强度, 且稳定性好。 钨灯是可见分光光度计常用 的光源。,b. 单色器 光电比色计: 用滤光片获得单色光。 选择滤光片的原则是: 滤光片最易 透过的光应是有色物质最易吸收的 光, 即滤光片的颜色与溶液的颜色应 为互补色; 也可以使用不同的滤光片 测量同一有色溶液的吸光度, 测得吸 光度最大时所用的滤光片就是最适 宜的滤光片。,分光光度计: 单色器由棱镜或光栅、 狭缝和准直镜等部分组成。 棱镜: 色散元件, 有石英或玻璃两 种, 它们对不同波长光具有不同的折 射率。石英棱镜对紫外光分光效果好, 玻璃棱镜对可见光分

8、光效果好, 因为 玻璃对紫外光有吸收, 故不能用于紫 外光区。,光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。,c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。,d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。,优点: 光电池灵敏度较高, 产生的光电 池不需要经过放大便可直接用 灵敏检流计测量。 缺点: 光电池经强光照射或连续使用时

9、 间过长, 易产生“疲劳现象”, 导致 灵敏度降低, 遇此情况, 应暂停使 用并避光放置, 待其复原后再用。,光电管: 国产721型分光光度计,e. 指示器,(3) 常用光电比色计和分光光度计 光电比色计: 国产581-G型, 仪器通 常配有红色、绿色、蓝色三块滤光 片, 其透过光的最大波长分别在650、 530和440mm左右。,可见光光度计: 国产721型分光光度计,四、显色反应及其影响因素 显色反应: 将被测组分转变为有色 化合物的反应称为显色反应。 显色剂:使被测组分显色的试剂称 为显色剂。,(1) 对显色反应的要求 选择性好 灵敏度高 有色化合物组成恒定 有色化合物的化学性质稳定 显

10、色剂在测定波长处无明显吸收,(2) 显色剂 显色剂可分为无机显色剂和有机显 色剂两大类。由于大多数有机显色 剂能与金属离子形成稳定的有特征 颜色的螯合物, 灵敏度较高, 选择性 也较好。因此, 在比色分析和光度分 析中主要选用有机显色剂。,两种常用的有机显色剂： 邻二氮菲 其结构式为 这是目前广泛用于测定Fe2+的较好的显色剂。先用盐酸羟胺把待测试液中的Fe3+还原为Fe2+ ,然后在pH56的条件下,与邻二氮菲反应,生成稳定的橙红色配合物，配合物的max为508nm.反应是特效的,灵敏度也较高，摩尔吸光系数为1.1104L/mol.cm。,. 双硫腙 其结构式为,(3) 影响显色反应的因素：

11、 显色剂的用量： 显色反应表示式: M+R MR (被测组分)(显色剂)(有色配合物) 显色剂的用量应当适宜,其用量是 通过实验确定。,实验方法为：固定被测组分的浓度和 其它条件,改变显色剂在溶液中的浓度 cR,分别测量吸光度(A),绘制A-cR曲线。, 溶液的酸度 适宜酸度范围确定方法： 固定显色剂和被测组分的浓度, 改变溶液的pH值,分别测量吸光度, 绘制A- pH曲线。曲线平坦部分所 对应的pH值即为适宜的酸度范围。, 显色时间 作吸光度-时间曲线, 确定适宜的 显色时间。 显色温度 溶剂的性质 共存离子的干扰及其消除,消除共存离子干扰的方法： a.控制溶液的酸度 b. 加入掩蔽剂 c.

12、 分离干扰离子,五、光度测量条件的选择 (1) 选择合适波长的入射光 选被测有色物质的max为入射 光 如在max处显色剂或干扰组分 有明显的吸收, 则应选灵敏度较 低但能避免干扰的适宜波长的光 作为入射光。,(2) 选择适宜的参比溶液 . 当被测溶液、显色剂及所用其他试剂均无色,可用纯溶剂作为参比溶液, 称为溶剂空白。 . 当显色剂无色而被测试液中存在其他有色离子时,可用不加显色剂的被测试液作为参比溶液,称为试样空白。 . 当显色剂或其他试剂有色,可用显色剂或其他试剂作为参比溶液,称为试剂空白。,. 用不含被测组分的试样, 在相同条件 下与被测试样同时进行处理, 测吸光 度时以前者所得溶液为

13、参比溶液, 称 为平行操作空白。如临床上进行某 种药物浓度的监测,取正常人血样和 待测血药浓度的血样在相同条件下 处理, 用前者得到的溶液作为参比溶 液。,(3) 控制适当的吸光度读数范围 适宜读数范围: 吸光度A在0.151.0内， 或透光度T值在0.100.70内。 六.比色法和可见分光光度法的定量方法 (1) 校正曲线法(适用于经常性的批量分 析） (2) 标准对比法（标准品对照法） 此法适宜于非经常性的分析工作。,当校正曲线通过零点时,将样品溶液和一标准溶液在选定实验条件下显色,测得吸光度分别为Ax和As,标准溶液的浓度为cs,则样品溶液的浓度cx可按下式求得：,在药物分析中, 为了测

14、定方便, 通常 使被测试样称样量和稀释倍数与标准 试样一致,则被测试样的含量可由测 量的两者吸光度的比求得,即,另外,在药物分析中,还常用与标准 品的比吸光系数比较进行含量测定。 如被测试样称样量和稀释倍数与标准 品一致,在相同条件下,测得被测试样 与标准品的比吸光系数分别为 和 则试样质量浓度 为,七. 比色法和可见分光光度法在医学检 验中的应用 全血中铁的测定 全血中铁的测定需要先将各种形式的铁转化为游离的Fe3+离子。通常用消化法,蛋白质用钨酸沉淀除去,取无 蛋白的滤液,在一定条件下加KSCN显色剂,生成血红色配合物,反应式为,在520nm波长处或用蓝绿色滤光片 测量吸光度,与标准溶液比较,求出含 量。,