细菌基础操作

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1、细菌培养细菌培养基础操作基础操作主讲人：李前 细菌培养的意义细菌培养的意义 标本的采集标本的采集 接种方法介绍接种方法介绍 菌落鉴定菌落鉴定 药敏试验药敏试验细菌培养意义 细菌培养是在无菌条件下，对来自病人的标本（采取病人少许的血液、排泄物、分泌物、呕吐物、体液和脱落细胞等样品）在合适培养基上进行培养，分离出致病菌，进行药物敏感性试验，进而指导临床用药。标本的采集血液标本的采集血液标本的采集 血培养是把静脉穿刺获得的血液接种到一个或多个培养瓶或培养管中，用来发现、识别细菌或其它可培养分离的微生物（如大肠杆菌(Escherichia coli)、念珠菌属、霉菌属等），这些微生物存在于血液中形成菌

2、血症或真菌菌血症。在病人的血液中检测出微生物对感染性疾病的诊断、治疗和预后有重要的临床意义。成人每次采血510ml，小儿采血23ml，严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定量血液后，无菌注入血培养瓶内，轻轻摇匀。及时送检。痰、尿、粪便标本的采集痰、尿、粪便标本的采集 1.令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即从下部呼吸道咳出第一口痰，吐在无菌密闭塑料痰盒中，及时送检。2.先准备无菌封闭尿杯，清洗外阴，留取中段尿510毫升，及时送检 3.取有粘液、脓血部分的粪便置玻璃大便专用管中，如为稀水便，可直接收集于玻璃管中 标本的采集标本的采集其它标本的采集其它标本的采集 除上述四种标本外，还有伤口

3、分泌物、脓液和脑积液等标本亦可进行细菌培养，需保证标本采集和保存的无菌。其中脑脊液可按血液标本方法操作。接种工具接种工具 酒精灯、接种环、加样器、棉棒、培养板等 接种方法四、点击添加标题接种方法 2.2.接种环境接种环境接种罩、无菌工作室、超净工作台接种罩、无菌工作室、超净工作台接种方法 细菌的接种方法有很多种，如划线法、细菌的接种方法有很多种，如划线法、涂布法、倾注法、斜面接种法、液体培养涂布法、倾注法、斜面接种法、液体培养基接种法。基接种法。根据样本形态和目的用途，选取合适根据样本形态和目的用途，选取合适的接种方法。的接种方法。接种方法1.涂布法涂布法 先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，

4、然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液接种在已凝固的琼脂平板上。再用无菌L型玻璃棒将菌液在平板上涂抹均匀，将涂抹好的平板平放于桌上2030min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。优点：可以计数，可以观察菌落特征。缺点：接种前需梯度稀释，吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。接种方法2.2.倾倒法倾倒法 吸取1ml菌液加入平板中，倒入已融化并冷却至4550的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。优点：可以计数，较方便。缺点：接种前需梯度稀释，不能观察菌落特征，不适用于严格好氧菌和热敏感菌。接种方法

5、 3.斜面接种法斜面接种法 用接种环或接种针伸入菌种管内，挑取用来移种的菌落。伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上地蜿蜒划线。接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，置于37培养。主要用于纯种移植，以进一步鉴定或保存菌种。接种方法接种方法 4.液体培养基接种法液体培养基接种法 用灭菌接种环挑取菌落或标本，在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌均匀得散落在液体培养基中。可观察到细菌不同的生长现象接种方法接种方法Click to add title 5.半固体穿刺接种法半固体穿刺接种法可用于保存细菌和观察细菌动力 接种方法Click to ad

6、d title说明性文字接种方法6.划线法划线法 接种环沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离。缺点：不能用于菌落计数接种方法一、分区划线分离法此法常用于含菌量较多的标本如痰、伤口分泌物和粪便或混合细菌的分离。1、右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取培养物少许。2、左手斜持琼脂平板，皿盖留在桌上，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端，來回划线，涂成薄膜（约占平板总表面积的十分之一），划线时接

7、种环与平板表面成3040角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应划破培养基表面。接种方法3、烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），作连续平行划线，此线需与初次划线尾部相交三到四次，约占平板表面五分之一左右，再次烧灼接种环，以同样方法作第三次划线，与第二次划线尾部相交三到四次。4.划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明接种者信息，置37孵育培养二十四小时后观察结果接种方法 连续划线分离法连续划线分离法此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养，方法是先将接种物在琼脂平板上五分之一处轻轻涂抹，然后

8、用接种环或释子在平板表面曲线连续划线接种，直至画满琼脂平板表面接种方法尿液接种尿液接种 用无菌5ul微量移液器吸取尿液加于血平板上呈一直线，再用灭菌接种环经圆心划成直径，接种环灭菌，之后沿直径向两边涂抹，让存在于5ul尿液标本中的细菌完全平蒲于整个琼脂表面上（充分利用表面积而不留下空隙）。尽量利用平板琼脂表面积让标本中的细菌完全平蒲开来。接种方法细菌鉴定 细菌鉴定细菌鉴定 首先观察菌落形态，生长情况，再进一步首先观察菌落形态，生长情况，再进一步用生理盐水稀释，在显微镜下观测，判断细菌用生理盐水稀释，在显微镜下观测，判断细菌菌属，是否需要进行药敏试验。菌属，是否需要进行药敏试验。药敏试验药敏试验

9、药敏试验 用药敏实验进行药物敏感度的测定，以便准确有效的利用药物进行治疗。但由于药敏试验要求比较严格，条件比较高。目前，临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要有纸片扩散法，稀释法（包括琼脂和肉汤稀释法），抗生素浓度梯度法（E-test法），和自动化仪器等。二氧化碳结合力一、纸片扩散法纸片扩散法 该法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加，抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成浓度梯度。同时，纸片周围抑菌浓度范围内的菌株不能生长，而抑菌范围外的菌株则可以生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈，不同的抑菌药物的抑菌圈直径因受药物在琼脂中扩散速度的影响而可能不同，抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的MIC呈负相关 四、点击添加标题 二、稀释法二、稀释法 稀释法药敏试验可用于定量测试抗菌药物对某一细菌的体外活性，分为琼脂稀释法和肉汤稀释法。实验时，抗菌药物的浓度通常经过倍比稀释，能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最小抑菌浓度最小抑菌浓度（MIC），一个特定抗菌药物的测试浓度范围应该包含能够检测细菌的解释性折点（敏感、中介和耐药）的浓度，同时也应该包含质控参考菌株的MIC。