活性GLP-17-36特效ELISA试剂盒

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1、KT-871 GLP-1(7-36)Epitope Diagnostics, Inc活性 GLP-1（7-36 ）特异性酶免试剂盒EDI ? Active GLP-1 (7-36) Specific ELISA KitEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) for the Measurement the Level ofHuman Osteocalcin (1-43) and Osteocalcin (1-49)美国 Epitope Diagnostics, Inc.KT 871For Research Use Only.Not for use in

2、 diagnostic procedureActive GLP-1(7-36) ELISA/IFU/Chinese/2011-0718/v11KT-871 GLP-1(7-36)Epitope Diagnostics, Inc活性 GLP-1 （ 7-36）特异性酶免试剂盒【预期用途】该高灵敏度 ELISA （酶联免疫吸附测定） 试剂盒是专门用来定量检测血清样本中的胰高血糖素样肽-1 （ 7-36 ） GLP-1 （ 1-36 ） 的浓度。哺乳动物中的 GLP-1 肽链的基本氨基酸序列完全相同，如：小鼠、大鼠、猪、狗、猴、人等。该试剂盒仅适用于科学研究。储存于 2-8，试剂在此条件下稳定至包装

3、标签上的有效日期。3. GLP-1 （ 7-36 ）捕捉抗体（ Cat. No. 30230 ）一瓶（ 0.6mL ）含生物素偶联的GLP-1 （ 7-36）特异抗体试剂。 本试剂必须先按照实验步骤与 GLP-1 示踪抗体和示踪抗体稀释液混合后， 才能直接用于胰高血糖素样肽 -1（ 7-36）检测。试剂应当储存于 2-8，试剂在此条件下稳定至包装标签上的有效日期。【实验原理】4. ELISA浓缩洗涤液， 30X (Cat. No. 10010)这个 ELISA的设计，研发和生产的目的是对血一瓶 30 mL 的 30 倍浓缩液。 使用前， 用 870 mL浆样品中的活性GLP-1 （ 7-36）

4、进行定量检测。该试的蒸馏水稀释，混合均匀。稀释后，洗涤液含表面活剂盒是基于运用两个GLP-1(7-36) 特异性抗体分别与化剂磷酸盐缓冲液， 其中不含叠氮化合物和无任何水两个位点结合的“双抗体夹心”技术。银防护层剂。 稀释液能在室温下储存，试剂在此条件将标准品、 质控品、 和待测样品加入链霉亲和素下稳定至包装标签上的有效日期。包被的微孔板中。随后，将生物素偶联的的GLP-15. ELISAHRP 基质 (Cat. No. 10020)（ 7-36）特异抗体和HRP 标记的 GLP-1(7-36) 特异抗一瓶含 24mL 3,3,5,5- 四甲基联苯胺（ TMB ）和体混合物添加到各个孔中。经过

5、第一个保温孵育期过氧化氢的溶液。试剂应当储存于2-8，试剂在此后，形成了“链霉亲和素 -生物素抗体 - GLP-1（ 7-36）条件下稳定至包装标签上的有效日期。-HRP 标记抗体”的“双抗体夹心”结构，该复合体6. ELISA终止液 (Cat. No. 30357)被微孔板的内壁吸附住。游离的HRP 标记抗体和缓一瓶含12 mL 稀硫酸的溶液。试剂可储存在冲基质则在洗涤过程中被冲走。微孔板加入过氧化物2-8或室温下，试剂在此条件下稳定至包装标签上酶基质（ 3,3,5,5-四甲基联苯胺， TMB ）并经过一段的有效日期。时间的反应后， 用酶标仪测量吸光度。微孔板内壁的7. GLP-1标准品 (

6、Cat. No. 30441 30446)免疫复合体的酶活性与样本中的GLP-1 （ 7-36）浓度六瓶含不同 GLP-1 （7-36）浓度的冻干粉剂标准成正比。品，其中不含叠氮化合物和无水银防护层剂。每瓶标准品的精确浓度请参照瓶上标签或该试剂盒的分析【试剂：准备和储存】证书。试剂应储存于 2-8中，试剂在此条件下稳定收到试剂盒后应在 2-8保存。试剂盒的有效期至包装标签上的有效日期。标于包装盒上。 试剂在此条件下稳定至包装标签上的8. GLP-1质控品 (Cat. No. 30447 30448)有效日期。两瓶含不同 GLP-1 （7-36）浓度的冻干粉剂质控使用前将试剂置于室温下复温。不同

7、批号的试剂品，其中不含叠氮化合物和无水银防护层剂。每瓶质不能混合使用。控品的浓度请参照瓶上标签或该试剂盒的分析证书。1.链霉亲和素包被的微孔板(Cat. No. 10040)试剂应储存于 2-8 中，试剂在此条件下稳定至包装盒一块链霉抗生物素包被的微孔板有12 条8 孔上的有效日期。（ 96个）。微孔板置于铝箔框架中，加入干燥剂，密9. 示踪抗体稀释液（ (Cat. No. 30017)封。储存于 2-8中，试剂在此条件下稳定至包装标一瓶试剂含有 12mL 现成缓冲液。 必须按照实验签上的有效日期。步骤来使用该示踪抗体稀释液。试剂应储存于2-82.GLP-1 示踪抗体（ Cat. No. 30

8、229)中，试剂在此条件下稳定至包装标签上的有效日期。一瓶（ 0.6mL ）含蛋白质稳定剂的HRP.标记抗GLP-1 特异性抗体试剂。 本试剂必须先按照实验步骤【安全措施】与 GLP-1 捕捉抗体和示踪抗体稀释液混合后，才能直试剂必须在专业的检验室使用。牛血清白蛋白等接用于胰高血糖素样肽-1（ 7-36）检测。本试剂应当制作试剂的生物原材料来源于美国内陆的48个州。Active GLP-1(7-36) ELISA/IFU/Chinese/2011-0718/v12KT-871 GLP-1(7-36)Epitope Diagnostics, Inc这些材料仅从完全健康的动物身上获得，这些动物自始

9、至终有兽医的监管，没有接触性传染病。进行实验时需要带上手套， 以防处理试剂时可能被感染。避免接触 TMB ，过氧化氢以及硫酸试剂。 TMB 对皮肤和黏膜有刺激性， 可能会造成皮肤的过敏性反应。硫酸对皮肤有严重刺激性， 不要将硫酸溅到眼睛、皮肤或者衣服上。不要吞咽或者吸入烟雾。若碰到硫酸，用大量的水冲洗 15 分钟以上。请按照最佳实验室规范进行各项操作。【必需材料（未提供） 】1.准确移取 25 L, 100 L,200 L,and 1000 L 等溶液的单通道移液器。2. 适合分装 100 L 液体的重复移液器。3. 适合上述液体的一次性使用移液枪头。4. 12 x 75 mm 或者 13 x

10、 100 一次性塑料试管。5. 100mL 和 1000mL 一次性塑料试管。6. 铝箔纸。7. 去离子水或者蒸馏水。8. 塑料测试孔膜或者聚乙烯薄膜。9. 酶标板振动器。10. ELISA 微孔板的洗涤瓶或者自动 （半自动） 洗涤系统。11. 酶标仪可读 OD450nm 。12. DPP-4 抑制剂。【样本采集】1. 样本收集前不需要做特殊准备。 空腹抽血和非空腹抽血样本其中活性 GLP-1 （ 7-36）浓度差异很大。2. 若要用这个 ELISA 试剂盒直接测量 GLP-1（ 7-36）的活性， 则必须要用 BD? P700 血液收集和存储系统（包括 DPP-4 蛋白质抑制剂混合物）收集样

11、本。3. 可用一个上部为紫色的真空采血管（ Vacutainer ）EDTA 血浆管代替 BD? P -700试管收集全血。必须立刻添加适当量的DPP-4抑制剂到刚收集好的 EDTA 全血中（ 30 秒内）。参考 DPP-4 抑制剂的说明书。将试管倒置混匀，然后放置在冰上。在冷冻离心机上离心10 分钟（ 1000g）。在进行 GLP-1 检测前，需要先进行固相样本提取。4. 若血浆样本取出后 3 小时内进行检验， 则可置于2-8的温度下。若要长时间保存，则应将血浆样本储存于 -70中。如有需要，可在冷藏前将样本分成小份。【检测方法】1. 试剂的准备（ 1） 使用前，将所有样本置于室温下复温。不

12、要将不同批号的试剂混合。（ 2） ELISA 浓缩洗涤液使用前必须稀释到适当的浓度。详见试剂具体说明。（ 3） 添加 1mL 的蒸馏水或者去矿物质水重新配制成液态标准品和质控品。 将液态标准品和质控品静置 10 分钟，然后轻轻旋转混匀。确保所有的固体物均已完全溶解。 重新配制的标准品和质控品必须储存在 -20及以下。冻融不得超过三次。2. 检测样品的准备直接测量活性 GLP-1(7-36) 时，样本的收集必须使用 BD? P -700 血液收集和储存系统。待检样本无需做任何预处理。如果待检样本是用其他试管收集的， 我们建议在测量活性 GLP-1(7-36) 前对待检样本进行固相样本提取预处理，

13、我们提供该 GLP-1 固相样本提取预处理的试剂盒（ GLP-1 Sample Extraction Kit, Cat .KT-910 ） 。3. 检测步骤将适当数量链霉亲和素包被的微孔板置于框架上，所需微孔板的总数是两份GLP-1(7-36) 标准品、质控品和未知样品数的总和。 将未使用的微孔板密封于装有干燥剂的锡箔袋中，2-8保存。（ 2） 实验结构组数条带 1条带 2条带 3ASTD 1STD 5样本 1BSTD 1STD 5样本 1CSTD 2STD 6样本 2DSTD 2STD 6样本 2ESTD 3C 1样本 3FSTD 3C 1样本 3GSTD 4C 2HSTD 4C 2Acti

14、ve GLP-1(7-36) ELISA/IFU/Chinese/2011-0718/v13KT-871 GLP-1(7-36)Epitope Diagnostics, Inc（ 3） 准备 GLP-1(7-36) 抗体混合物：将GLP-1 示踪抗体和捕捉抗体混合，用示踪抗体稀释液1:21分别稀释示踪抗体（30229）和生物素标记的捕捉抗体（ 30230）。对于每一个条带来说，需要在干净的试管中加入1mL 示踪抗体稀释液（ 30017），50L 捕捉抗体以及 50L 示踪抗体混合液。多个条带依此类推。（ 4）在指定的孔中分别添加 100L 标准品，质控品和待测样本。（ 5） 各个孔中添加 10

15、0L 的 GLP-1(7-36) 抗体混合物。（ 6） 用封口膜封住微孔板， 2-8静置培养 20-24 小时。（ 7） 将封口膜揭开，吸出每个孔中的物质。用350L 活性的洗涤液将各孔清洗 5 次，完全洗净。也可以用 ELISA 微孔板自动洗涤器清洗。（ 8） 添加 200L ELISA HRP 基质到各个孔中。（ 9） 用新封口膜密封，再用铝箔遮光，或仅用铝箔遮光。（ 10）将微孔板在室温下静置 20 分钟。（ 11）将铝箔和封口膜移开。添加50L ELISA 终止液到各个孔中，轻轻混匀。（ 12）立刻在酶标仪上读取 450nm/620nm 或者 450nm/650nm 下的吸光度。【注意

16、事项】1.检验样本中存在有活性的内源性DPP-4 酶，可能导致错误的实验结果。2. 建议所有的标准品、 质控品、 和未知样本均做双管。使用平均吸光度用作数据简化和结果计算。3. 若样本浓度高于标准品 6 的，建议用适当的 GLP-1 游离缓冲基质（如标准品 0）稀释样本后进行检测，以获得更加精确的结果。4. 将光敏试剂（ TMB ）保存在原始琥珀瓶中。5. 将未使用的链霉亲和素条放入装有干燥剂的铝箔袋中，以防受潮。6. 精心操作， 以及合理使用有效精密的移液器和相关设备是确保测试精确性的必要条件。7. 不遵循本说明书的操作程序，培养时间或者温度，可能影响到最终实验结果。8. 避免微孔板中出现气

17、泡，它可能会降低结合效力，使同一样品双管吸光度的CV% 增高。9. 所有的试剂在使用前轻轻地彻底地混匀。防止出现泡沫。【结果说明】1. 计算同一标准品、 质控品和未知样品双管吸光度的平均吸光度。2. 减去从其他所有数据的平均吸光度所得来 STD1 （ 0ng/mL ）平均吸光度，获得校正吸光度。3. 标准曲线是由所有标准水平的校正吸光度 （纵坐标 )和标准浓度（横坐标）做成的“点到点”或者“对数”曲线。结果计算时可利用计算机辅助数据分析程序。我们推荐使用“点到点”二次曲线拟合程序。用质控品和检验样本的GLP-1(7-36) 浓缩液的校正吸光度，能直接从标准曲线上读出他们的GLP-1（ 7-36

18、）浓度。如果使用对数图或者电脑辅助数据程序进行对数转化，样本在 2nd 标准和下一个最高标准之间的校正吸光度需要用公式进行计算。较正吸光度(未知样本 )样本结果 =x 2nd STD 值较正吸光度(2 nd STD)【参考数据和标准曲线】GLP-1 ELISA的一组典型的吸光度数据和对应的标准曲线。这条参考曲线由“点到点” 曲线拟合而成，也可用线性或者对数坐标轴做其他曲线拟合。该曲线不能代替其他实验的标准曲线。OD 450 nm/650 nm吸光度标准品实验结测量吸平均吸修正吸浓度果光度值光度值光度值(pmol/L)0pmol/0.0100.0110.000mL0.0110.640.0540.

19、0550.044pmol/L0.0572.200.1570.1650.154pmol/L0.1746.200.4510.4510.440pmol/L0.45121.001.3991.3851.374pmol/L1.370Active GLP-1(7-36) ELISA/IFU/Chinese/2011-0718/v14KT-871 GLP-1(7-36)Epitope Diagnostics, Inc48.002.7412.7632.752pmol/L2.785质控品 10.4560.4570.4466.290.458质控品 20.9180.9250.91413.710.932Active G

20、LP-1 (7-36) ELISA3mn02.556/0254DO1.5taec1nabro0.5sbA001020304050GLP-1 (7-36) Standards (pmol/L)【临床应用预期值】建议各实验室在正常健康人群中收集的样本建立自己的正常值范围。空腹和非空腹人群中的正常值范围有所不同。以下是不同浓度单位的换算公式：GLP-1(7-36) pg/ml = GLP-1 (7-36) pmol/l x 3.298分析少量正常捐赠者的样品（n=10 ），我们发现正常的空腹捐赠者的浓度为0.5-3.1pmol/L，非空腹的正常捐赠者的浓度为0.6-16.7pmol/L。从下表中能看

21、出非空腹者的活性 GLP-1(7-36)比空腹者的要高得多。活性 GLP-1 (7-36), pmol/L捐赠者空腹捐赠者非空腹捐赠者10.8474.42321.3935.96131.0488.58242.3480.58150.7771.53261.52516.69270.5405.52882.6584.28093.0618.917101.5189.961【测试的局限性】1.因为没有国际标准的标准品来校正 GLP-1(7-36) 检测，因此本试剂盒检测的标准值是建立在高纯度 GLP-1(7-36) 多肽基础上的。不同实验方式和试剂盒所得的数据不能交换使用。2. 从实验中直接读取的未知样品值比实

22、验标准品 6 浓度高， 建议将样品稀释后再进行检测， 使结果更准确。3. 血浆样品或者试剂受到细菌或者真菌污染， 或者试剂间的交叉污染可能导致结果错误。4. 用聚酯树脂生产的去离子水可能使辣根过氧化氢酶失活。【质量控制】在每轮实验中，应当在已知 GLP-1(7-36) 水平上使用足够的质控品以确保结果的准确性。【产品性能】灵敏性这个高敏活性 GLP-1(7-36)ELISA 的分析灵敏度约为 0.05pmol/L ，它由 12 个标准品 0 的平行测定的3 倍标准偏差得出。特异性本试剂盒是专门用于检测生物活性 GLP-1(7-36)-amide 。本试剂盒不检测除 GLP-1(7-36)以外的

23、相关多肽：GLP-1 (7-36)100%GLP-1 (9-36) 0.1%GLP-1 (9-37) 0.1%GLP-1 (7-37) 0.1%GLP-1 (1-36) 0.1%GLP-2 0.1%Glucagon 0.1%精确性分析内变异系数（ intra-assay ）是在同一实验中取两个病人的样本重复测试 8 次所获得的。 CV% 的最佳值如下表所示。样本编号GLP-1 (7-36) 平均值SDCVActive GLP-1(7-36) ELISA/IFU/Chinese/2011-0718/v15KT-871 GLP-1(7-36)Epitope Diagnostics, Inc(n =

24、 8)样本 13.49 pmol/L0.195.4%样本 210.18 pmol/L0.262.5%分析外变异系数(inter-assay) 是进行 13 次不同实验， 每次分别在两个病人上取两份样本进行实验所获得的。根据实验， CV% 的最佳值如下表所示。#GLP-1 (7-36) 平均SDCV值(n = 13)样本 14.13 pmol/L0.163.9%样本 212.14 pmol/L0.685.6%添加回收率将病人样本与样本等量混合（200 l + 200）l，并用本实验测量，计算回收率。样本样本测量值预期值回收率(pmol/L)(pmol/L)(pmol/L)(pmol/L)(%)3

25、2.457.4918.5619.9892.96.6718.6211.2512.6589.02.407.614.125.0082.4线性用 GLP-1(7-36) 标准品 0 基质对两个样本稀释。对这些稀释液用本实验进行检测，计算线性回收率。样本稀GLP-1测量值预期值线性回释量(7-36)(pmol/L)(pmol/L)收率 (%)零度人血清样本 150l250 l0.640.7091.3100 l200 l1.061.3976.1150 l150 l2.212.12104.3200 l100 l2.882.82102.2250 l50 l4.183.55117.9样本 250l250 l2.

26、702.7996.7100 l200 l5.095.5591.8150 l150 l7.498.3489.8200 l100 l11.4011.13102.5250 l50 l13.3713.8996.3【保证条款】产品按说明书使用时， 其性能与标签和文献上描述的相一致。 拒绝对抗原表位诊断等具有任何特殊用途的适销性或者实用性的默示担保， 对抗原表位诊断等造成的间接损害不承担责任。 当试剂盒出现质量问题时，买方可以换货或者取得退款。 除本条款赋予您特定的法律权利外， 在不同国家， 您也可能获得其他权利。【参考文献】1. Levy JC. Therapeutic intervention in

27、the GLP-1 pathway in Type 2 diabetes. Diabet Med. 2006 Mar;23 Suppl 1:14-9.2. Mannucci E, Ognibene A, Cremasco F, Bardini G,Mencucci A, Pierazzuoli E, Ciani S, Fanelli A, Messeri G,Rotella CM. Glucagon-like peptide (GLP)-1 and leptin concentrations in obese patients with Type 2 diabetes mellitus. Di

28、abet Med. 2000 Oct;17(10):713-9.3. Nauck MA, Weber I, Bach I, Richter S, Orskov C, Holst JJ, Schmiegel W. Normalization of fasting glycaemia byintravenous GLP-1 (7-36 amide or 7-37) in type 2 diabetic patients.Diabet Med. 1998 Nov;15(11):937-45.4.Byrne MM, G? ke B. Human studies with glucagon-like-p

29、eptide-1: potential of the gut hormone for clinical use.5. Mannucci E, Tesi F, Bardini G , Ognibene A, Petracca MG , Ciani S, Pezzatini A, Brogi M, Dicembrini I, Cremasco F, Messeri G, Rotella CM. Effects of metformin on glucagon-like peptide-1 levels in obese patients with and without Type 2 diabet

30、es. Diabetes Nutr Metab. 2004 Dec;17(6):336-42.简要实验步骤：在各孔中添加 100 L 的标准品、质控品和病人样本；在各孔中添加 100 L 抗体混合物；2-8 静置培养20-24 小时；用稀释洗涤缓冲液洗净条带；各孔中添加200 L 的 TMB 基质；室温下静置20 分钟；添加 50 L 终止液；Active GLP-1(7-36) ELISA/IFU/Chinese/2011-0718/v16KT-871 GLP-1(7-36)Epitope Diagnostics, Inc读取 450nm/620nm和 450nm/650nm下的吸光度。Active GLP-1(7-36) ELISA/IFU/Chinese/2011-0718/v17