自噬在心肌缺血再灌注损伤中的不同作用研究

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1、自噬在心肌缺血再灌注损伤中的不同作用研究 南方医科大学级博士学位论文自噬在心肌缺血.再灌注损伤中的不同作用/课题来源:国家自然科学基金广东省自然科学基金团队项目专 业 名 称科一一学位申请人指 导 教 师羲一爵一答辩委员会主席圳一徘一一诽答辩委员会成员 李自成一一一一一黄巧冰程继东刘世明论文评阅人 苏磊张文清黄巧冰邱健余细勇程继东日广州年月/四博士学位论丈自噬在心肌缺血.再灌注损伤中的不同作用博士研究生:徐秋林指导教师:廖禹林宾建平摘要研究背景冠心病是心血管疾病中引起死亡的首要原因。冠脉狭窄引起心肌缺血甚至心肌梗死心梗与病死率密切相关,缺血时间越长,心梗面积越大,患者预后越差。尽快恢复心肌灌注

2、,挽救濒死心肌,防止梗死扩大是急性心梗的基本治疗原则。然而,再灌注会引起再灌注损伤/ ,/损伤。/损伤的机制包括氧自由基生成增加、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、内皮细胞活化和损伤以及自噬等。其中自噬是目前研究的热点,被认为在心肌缺血.再灌注损伤中发挥着非常重要的作用。自噬是溶酶体介导的对长命蛋白质和损伤细胞器进行回收的过程,对线粒体等细胞器的降解和周转起关键作用。在/时,细胞内减少以及激活的蛋白激酶? ,活性增高均可激活自噬信号通路。另外,唯域蛋白的表达上调、细胞内钙离子浓度增加、活性氧分子,、过量的一氧化氮、线粒体通透性转运孔的开放、内质网应激和非折叠蛋白反应 ,等均可促进心肌细胞

3、的自噬。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 ,信号通路、/依赖的蛋白激酶通路、胰岛素/生长因子信号通路以及.通路调节着自噬活性。在真核细胞中,雷帕摘要霉素可抑制而激活自噬,而一甲基腺嘌呤、渥曼青霉素等可通过抑制磷脂酰肌醇激酶 ,而抑制自噬。线粒体是心肌细胞总含量最丰富的细胞器,其对于维持细胞功能非常重要。心肌细胞/会导致线粒体功能障碍,主要表现为线粒体膜电位除极化以及线粒体通透性转换孔,开放。线粒体功能障碍可以使心肌减少,氧自由基生成以及促凋亡蛋白释放,造成细胞死亡。氧自由基又可以进一步加重线粒体损伤,形成恶性循环。线粒体膜电位除极化、线粒体通透性转换孔开放以及氧自由基均可激活自噬,后者清除损伤的线粒体,

4、从而挽救濒死的心肌细胞。然而,当自噬过度激活时,自噬可过度清除细胞内的细胞器,从而引起细胞自噬性死亡。大量文献报道在心肌细胞缺氧/复氧/,/以及心肌/时,自噬活性上调。但在/或/的时程与自噬活性的关系上存在争议。有研究认为缺血或缺氧时间过短不改变自噬活性,也有报告显示缺血抑制而再灌注上调自噬活性,甚至有研究提出缺血期的自噬增强保护心肌,而再灌注期的自噬增强则损害心肌。多数研究报告啮齿类动物缺血超过和/或再灌注时间超过均可促进心肌细胞的自噬。不少研究认为自噬的增强对缺血心肌有保护作用,但同样也有不少研究认为自噬加重心肌损伤。关于自噬在/的作用之所以会产生如此大的分歧,可能与实验设计和研究于段的局

5、限性有关。文献报道的相关研究,多是对单一/状态下的集中研究,而没有对不同/状态下自噬功能作用进行比较性研究。比如,轻度和重度/损伤时,自噬增强所产生的作用未必是一样的。我们设想,过低或过高的自噬可能都是有害的,那么用基因敲除和过表达的研究于段得出的结果应该谨慎解释。如果能确定心肌/损伤时自噬的“安全范围”,则有望操控自噬活性来达到治疗目的。研究目的博士学位论文在新生大鼠心肌细胞培养的/模型和小鼠心肌/模型中,观察不同的缺氧时间和缺血时间对自噬活性的影响,并用自噬增强剂雷帕霉素和自噬抑制剂渥曼青霉素调节自噬,来研究自噬在心肌细胞/及心肌/中的作用及其机制,借此阐明自噬在/损伤中的作用机制,为心肌

6、的/损伤提供有效的治疗靶点。方法.离体研究分离.日龄乳鼠中心肌细胞,按常规进行原代培养,做下列检测:,法检测细胞生存,.二甲基.噻唑基,.率,设对照组、雷帕霉素组和渥曼青霉素组,置于缺氧孵箱中分别缺氧、比色,于分光光度仪下测吸光度值,比较各组细和,然后复氧,胞生存率变化。凋亡检测将心肌细胞接种于激光共聚焦小皿,设对照组、雷帕霉素和渥曼青霉素组,药物预处理后,置于缺氧孵箱中分别缺氧、和,复氧。用 染核,检测心肌细胞凋亡率。检测自噬将细胞接种于孔板或激光共聚焦小皿,单丹磺酰尸胺,染色后用激光共聚焦检测其荧光信号,定量分析自噬活性;或将细胞用胰酶消化、离心后用戊二醛固定,电镜检测其中自噬体形成;或提

7、取细胞总蛋白,用免疫印迹 分别检测.和的表达水平。检测开放,将钙黄绿素和氯化钴与心肌细,漂洗次,胞共孵育后,磷酸盐缓冲液胰酶消化后,用等体积含%胎牛血清/终止消化,流式细胞仪检测其荧光强度。激光共聚焦检测:将钙黄绿素和氯化钻与心肌细胞共孵育后,漂沈次,激光共聚焦检测。线粒体膜电位除极化检测:将.探针与心肌细胞共孵育后,漂沈次,激光共聚焦检测线粒体膜电位除极化水甲。摘要.在体研究在动物水平上,将.周龄/小鼠分为对照组、雷帕霉素组和渥曼青霉素组,腹腔注射药物后,麻醉,人工呼吸,左侧第肋间开胸,暴露心脏,结扎左冠状动脉,分别缺血后松开结扎,恢复冠脉灌注。假手术组只开胸不结扎。观察指标:酶联免疫吸附实

8、验?法检测血清乳酸脱氢酶 ,、,一氯化三苯基四氮唑,法测定心梗面积、超声检查左室内径和收缩功能、免疫印迹及电镜检查自噬水平。计量数据以均数标准误表示,统计分析采用 .软,两两比较采用法。计量资料用件完成,多重比较采用.卡方检验。.被认为有统计学意义。结果.心肌细胞自噬活性随缺氧时间延长而增强和自噬体上的酸性物质结合显示为蓝色,在自噬形成的时候会聚集成团块状。我们发现随着缺氧时间延长,心肌细胞中蓝色颗粒数量及面积均显著增多.。在电镜观察下,自噬体为特有的双层膜结构,内含有损伤的细胞器。结果显示,细胞内的自噬体数量随着缺氧时间延长而明显增加尸. 用检测.和时发现,缺氧使.和蛋白表达量显著增加。.干

9、预自噬对/心肌细胞生存的影响将药物预处理心肌细胞后,分别进行缺氧.后复氧。在缺氧时,心肌细胞存活率显著下降,自噬增强剂雷帕霉素增加缺氧心肌细胞的存活率,而自噬抑制剂渥曼青霉素则降低细胞存活率。而在缺氧时,雷帕霉素降低心肌细胞存活率,渥曼青霉素则改善细胞生存率。博士学位论文.干预自噬对/心肌细胞凋亡和自噬性死亡的影响用 来染核,凋亡细胞核固缩,被染成亮蓝色。在非用药的/组,随着缺氧时间延长,凋亡细胞核逐渐增加。在常氧组,雷帕霉素和渥曼青霉素对细胞凋亡率无影响。但是将心肌细胞缺氧、,复氧组,雷帕霉素处理组均可使一肌细胞凋亡率下降,而渥曼青霉素增加凋亡。然而用电镜观察细胞自噬性死亡,结果发现在缺氧的

10、/组,雷帕霉素和渥曼青霉素对自噬性死亡无明显影响,而在缺氧的/组,雷帕霉素增加自噬性死亡,渥曼青霉素则抑制之。.干预自噬对线粒体功能的影响用钙黄绿素和氯化钴共孵育的方法来检测心肌细胞开放情况,随着缺氧时间延长,流式细胞仪检测到的线粒体平均荧光强度下降,表明心肌细胞线粒体转换孔开放增加。用激光共聚焦检测细胞内绿色荧光强度,增加则表明开放降低,线粒体功能稳定。结果与流式细胞仪检测结果一致。荧光探针.可以作为线粒体膜电位的指示剂,其红/绿荧光的比值可以反应线粒体膜电位的变化情况。结果发现随着缺氧时间延长,线粒体红/绿荧光比值逐渐下降,表明线粒体膜电位除极化增加。雷帕霉素和渥曼青霉素不明显改变常氧心肌

11、细胞的开放程度。在轻度缺氧时,雷帕霉素可降低的开放,而渥曼青霉素作用相反。但在缺氧的/组,雷帕霉素由于增强自噬而导致线粒体数量减少,从而降低线粒体内的荧光强度,而渥曼青霉素仍会继续增加的开放。.干预自噬对/心肌细胞释放及心梗面积的影响小鼠心肌缺血及,再灌注时,加上缺血共三组,心/组,雷帕霉素可显著缩小心梗梗面积和血清依次增加。在缺血面积、减少的释放,渥曼青霉素的作用效果相反。在缺血组,雷帕摘要霉素反而增加心梗面积,而渥曼青霉素则缩小之。电镜检测显示各组的自噬水平也是依次增加,雷帕霉素增加心肌细胞自噬,而渥曼青霉素则抑制之。结论.缺氧或缺血时间延长可导致心肌细胞自噬活性增强,提示自噬活性与损伤程

12、度关联。.在自噬水甲较低时,适当增加自噬对心肌细胞起保护作用,其机制可能与促进细胞垃圾清除,降低线粒体转换孔的开放,从而抑制细胞凋亡有关。.在细胞损伤严重,自噬活性较强的情况下,进一步增加自噬可促进自噬性细胞死亡,而抑制自噬反而能增加心肌存活、限制梗塞面积。关键词:自噬;凋亡;缺血.再灌注损伤;缺氧.复氧;线粒体通透性转换孔;线粒体膜电位博士学位论文 :;:. /. . . , ./, , . /., ? ? , / ,. ., ,.,/? / 一,. ,. / . ,.,., ., ./ /,/ /.,博士学位论文. . . /., / ./. ./ / /.: .: .:,. ., , ,

13、【一,一一一一,一 】.:. . : 一 , .:, .: , ,一. / /., .:.博士学位论文. ,一.?,. .,. , . ./, . /, ./ . . /. , , ./ . , , . 一. / , . 博士学位论文./,./ , , . /? / / ./ , .,. .,. , ./ / . ., .:; ;?;博士学位论文目 录摘要目录?.前言?. 日吾材料与方法?.实验动物及材料?主要试剂的配制?.主要实验仪器实验方法.统计学分析?.结果?.一. :木?.讨论?.结论.参考文献缩写词简表?.致射?.博士研究生期间发表论文情况学位论文原创性声明统计学审稿证明?博士学位论

14、文前言.缺血.再灌注损伤是急性心梗治疗后常见的损伤机制冠心病是心血管疾病中引起死亡的首要原因。据世界卫生组织估计,年全球有万人死于心血管疾病,占全部死亡人数的%,其中冠心病引起的死亡人数达万。另外,据估计,到年,心血管疾病的死亡人数可以达到万人。因而,在今后相当长的一段时间内,冠心病是引起死亡的首要原因。在美国,每年有约万人患急性心肌梗塞,另有约万人因为各种心脏手术而出现心脏停博。冠心病的发病机制是由于脂质代谢异常,血液中的脂质沉着在原本光滑的冠状动脉内膜上,在动脉内膜一些类似粥样的脂类物质堆积而成白色斑块,这些斑块渐渐增多造成动脉腔狭窄,使血流受阻,导致心脏缺血,产生心绞痛。如果动脉壁上的斑

15、块形成溃疡或破裂,就会形成血栓,使整个血管血流完全中断,发生急性心肌梗死,甚至猝死。冠心病的少见发病机制是冠状动脉痉挛血管可以没有粥样硬化,产生变异性心绞痛,如果痉挛超过分钟,也会导致急性心肌梗死甚至猝死。研究表明,心肌缺血的时间与心肌梗死的面积和患者的病死率密切相关,缺血时间越长,心肌梗塞面积越大,患者预后越差。因而,治疗原则是尽快抢救恢复心肌的血液灌注,以挽救濒死心肌,防止梗死扩大或缩小心肌缺血范围,保护和维持心脏功能,及时处理并发症。随着医疗技术的发展及经皮冠状动脉腔内血管成形术、溶栓等各种治疗缺血性心脏病方法的广泛开展,的病死率已经得到很大下降。然而由于绝大部分事件发生在院外,患者往往

16、因为无法及时到达医院而错过开通梗塞血管的最佳时机;另外,在医疗资源缺乏的偏远地区或者一些医疗条件较差的发展中国家,梗塞心肌的再灌注也成为一个困难的问题。因而,如何在心肌缺血的情况下减少心肌梗死面积、延缓心肌梗死速度,尽可能的保护心脏的功能具有非常重要的意义。另外,对前言于那些即使能够及时接受介入或者药物溶栓治疗使得梗塞冠脉再通的患者,哪怕其心肌缺血时间非常短,心脏再灌注后的心功能恢复仍然不如预期的那么好。很多患者再灌注后缺血的心肌出现舒缩功能降低、心律失常、心肌能量代谢障碍、超微结构的变化及血管无复流等现象。这主要是由于心肌缺血后的再灌注损伤所引起的。心肌缺血再灌注损伤,/损伤是指心肌缺血基础

17、上恢复血流后组织损伤加重、甚至发生不可逆损伤的现象。后来的研究发现,心脏的/损伤涉及多种分子和细胞机制,包括氧自由基、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、内皮细胞活化和损伤以及自噬等。其中自噬是目前研究的热点,被认为在心肌缺血.再灌注损伤中发挥着非常重要的作用。.自噬在心肌缺血.再灌注损伤中的作用及其机制自噬是生物进化过程中形成的在溶酶体内降解细胞质成分的一种保守生理过程。正常情况下,它通过不问断的回收细胞的成分,如长寿命蛋损伤细胞器来对细胞进行修复,维持生命的延续。许多生物过程都涉及到自噬,例如,细胞分化、组织重塑、生长控制、细胞防御,以及适应不合适的外部环境。根据细胞质内的成分进入溶酶

18、体的方式可将自噬分为三种类型:巨自噬,是指小的细胞质和细胞器螫合在双层膜空泡上,即自噬体,被运输到溶酶体内降解;微自噬,是细胞质直接被溶酶体包裹消化;分子伴侣介导的自噬,指溶酶体表面的受体选择性地与胞浆内蛋白结合并介导其进入溶酶体腔内。通常所说的自噬为巨自噬。在真核细胞生物中,自噬受着严格信号调控。目前发现的参与真核细胞自噬调控的信号通路如下:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,信号通路有两个功能不同的蛋白复合体,和。其中是雷帕霉素的靶蛋白,在自噬的调节中起着非常重要的作用。在博士学位论文营养丰富的情况下,被激活而抑制自噬;当营养缺乏时,被抑制而激活自噬。对自噬的调节主要通过下列两个途径来调节自噬:首先是

19、调节?激酶复合体的形成,后者可以增加自噬活性;其次,通过作用于其下游靶蛋白来调控自噬。例如通过对的磷酸化来调节自噬活性。在哺乳动物中,蛋白对自噬的调控更加复杂,它不仅受细胞的营养状况调控,还受激素的调控,如胰岛素受体、胰岛素受体底物和、以及/,。/依赖的蛋白激酶通路/在营养丰富的情况下,种酶和激活腺苷环化酶生成,后者与调节亚单位结合,使其与的个催化亚单位、和解离,导致激活,从而抑制自噬。对自噬的调节可能与其对自噬相关蛋白、和磷酸化相关。胰岛素/生长因子信号通路即使在营养丰富的情况下,当细胞外的生长因子减少时,自噬被激活。在高等真核生物中,激素对自噬的调节与营养不同,但是它们最终在处汇合。胰岛素

20、和胰岛素样生长因子可以通过 来调节。当激素缺乏时,失活,从而激活自噬。通路当细胞内能量缺乏时,/比值下降,通过使激活。活化的引起/复合体的激活,后者通过抑制,从而激活自噬。另外在激素缺乏或营养缺乏的情况下,.通路还可以磷酸化激活。,从而激活自噬,抑制细胞凋亡。前言其它途径另外,各种应激反应也均可激活自噬,如内质网应激、缺氧、氧化应激以及病原体感染。正常情况下,机体的绝大部分细胞都维持着基础的自噬活性。另外,自噬可以被细胞外如营养缺乏、缺氧以及高温等和细胞内的应激如损伤或者多余细胞器的聚集所激活。在一些疾病状态下,如肿瘤、神经退行性疾病、病原体入侵以及肌肉和肝脏功能失调等均可激活自噬。自噬可发挥

21、着有害和有益的作用,即细胞保护和细胞损伤的双重作用。在凋亡的过程中,自噬的激活具有保护作用;但同时,自噬又可以引起另一种类型的程序性细胞死亡,白噬性细胞死亡,也称为型细胞死亡。事实上,过度自噬会破坏细胞质和细胞器的主要成分,如线粒体和内质网,从而导致整个细胞功能的崩溃, 自噬性细胞死亡同细胞凋亡和坏死的不同之处在于,不具备核浓缩、半胱天冬酶活化、片段化及细胞肿胀。自噬在心脏中也发挥着重要的作用。心衰和心肌肥厚均可诱导激活心肌细胞自噬。大量文献报道在心肌/中自噬活性增强。最初,在对胚胎小鼠心脏进行缺氧和无糖培养及再灌注时发现心肌自噬增强。随后研究发现在灌注的兔心脏中,缺血不足以诱导自噬,而在再灌

22、注时自噬才升高。但是缺血时间延长为时白噬增高,再灌注后自噬进一步升高。这表明依均可增高自噬等发现,在模型中,缺血,再灌注可以导致自噬的显著升高。在对培养的心肌细胞进行缺氧/复氧/,处理时也同样发现自噬活性的增强。尽管关于心肌/中自噬的研究较多,自噬的作用仍不明确。很多研究认为自噬增强在心肌/可能导致细胞死亡。等发现,无糖培养的心肌细胞自噬增强的同时细胞死亡增加,而使用.甲基腺嘌呤.,和抑制自噬后可以减少细胞死亡,提示自噬可以导致细胞死亡螺。博士学位论文另有研究发现,在培养的心肌细胞进行/刺激时,通过下调 表达或者使用抑制自噬可以减少细胞死亡,。然而等的研究发现,自噬在缺血过程中起保护作用,而在

23、再灌注时起损伤作用。另外,等在压力负荷的心衰模型中发现自噬活性增强可导致细胞死亡。另外,也有很多文献报道自噬在/中起着有益的作用, 。等在猪慢性心肌缺血实验中发现,自噬作用的增强能使细胞凋亡率下降,而发生凋亡的细胞中自噬受到抑制。在培养的心肌细胞模拟/模型中,等发现,在葡萄糖剥夺培养的心肌细胞中,抑制自噬可以增加细胞死亡。在.心肌细胞中,下调自噬基因或 表达可以抑制自噬,同时也导致/诱导的细胞凋亡增加,而过表达则增强自噬,使细胞凋亡率下降。在/过程中,线粒体蛋白被激活,诱导自噬作用上调,通过自噬对损伤线粒体的降解而对抗细胞凋亡的诱导。人们公认的短暂的轻度缺血预处理 ,能够减轻随后严重的缺血损伤

24、,而且发现能诱导自噬。如果抑制自噬,则的保护作用就会消除。另外,雷帕霉素、他汀类药物等能够有力地诱导自噬,对抗/损伤,缩小心肌梗死范围,从而产生保护作用。因此,尽管目前对心肌/自噬的研究较多,自噬究竟发挥着什么样的作用仍无定论。.自噬与线粒体损伤之间的关系心肌能量耗竭是心衰的主要病理生理机制之一。线粒体是提供能量的最主要场所,线粒体损伤使能量产生不足,促使心功能进一步恶化。另外,线粒体损伤在细胞凋亡中起决定性作用,而心肌细胞凋亡是心力衰竭的重要机制。线粒体损伤的主要表现之一是线粒体膜通透转换孔开放,使膜通透性增高,从而促进细胞凋亡和自噬。,具有折叠蛋白、维持钙稳态及脂质生内质网前言物合成等功能

25、。氧化应激、缺血等刺激可引起未折叠或错误折叠蛋白的过度聚集,从而导致功能障碍,这个过程被称为应激。应激可触发未折叠蛋白质反应,激活一组信号通路来处理未折叠或错误折叠的。适度的通过增加位于的伴侣蛋白来抑制新的蛋白质合成并加速降解未折叠和错误折叠蛋白,有利于维持细胞正常功能。但持续或严重的则触发相应的细胞凋亡信号通路,如果发生在心脏,则促进心哀的发生和发展。线粒体损伤、自噬和应激三者之间有紧密的联系。应激与线粒体损伤相互关联:信号可以激活和诱导包括、在内的多种促凋亡蛋白质,并能激活信号通路。而、表达量的上调会引起线粒体膜通透性增高,膜电位除极,导致线粒体依赖的细胞凋亡。可以磷酸化、来增强其促凋亡活

26、性。另外,还可以上调促凋亡因子/的表达,是一个转录因子,可以抑制一和上调的表达。而促凋亡蛋白、可以与伐结合,激活的通路,基因敲除/则的底物及其靶基因表达下降 应激与自噬的关系:内质网膜是自噬体膜的主要来源。总的来说,应激是很强的自噬诱导因子。信号中的、通路均可激活自噬,而通路则负向调节自噬活性。自噬的激活可以帮助降解聚集的蛋白质,减轻应激。线粒体损伤与自噬的关系:自噬通过清除损伤的线粒体来防止细胞内的聚集。在多种刺激的作用下,线粒体膜的通透性发生改变,发生电位除极,除极化的线粒体膜可以通过线粒体激酶或信号通路来引起线粒体自噬。线粒体膜通透转换孑 ,开放可诱导自噬,而抑制剂环雹素可阻止自噬弱,表

27、明线粒体通透性增高与自噬有关。四有待解决的问题及我们的假设博士学位论文虽然离体和在体研究都观察到心肌瓜时心肌细胞自噬水平增高,但对其产生何种功能性作用并不清楚。关于自噬在心脏中的作用仍然有很多需要回答的问题。有可能存在不同的信号通路来触发促进与细胞存活和死亡相关的自噬。因此,有必要探明在什么条件下自噬促进细胞生和死及其相关机制。虽然有证据表明线粒体损伤、自噬之间存在相互联系,但很少有研究对将二者联系在一起的信号系统进行探索。基于类似的逻辑,我们假设在/时适度的自噬水甲对心肌有保护作用,而过低和过高的自噬均会加重心肌损伤。其可能机制是适度自噬可清除受损的蛋白质和细胞器,有利于维持细胞的正常功能:

28、自噬水甲过低会使受损的蛋白质和细胞器不能被及时清除,造成蓄积而加重心肌损伤;过度自噬则可能会使功能正常的蛋白质分子及细胞器被清除,也会加重心肌损伤。我们设想在轻度瓜损伤如/时间较短时,自噬增强会激活细胞存活的信号通路;相反,严重的/损伤如长时间缺血后再灌注,则可能会由于长期过度的自噬激活使正常的细胞器和蛋白质过度自我消化而促进细胞死亡;而大量的心肌细胞丧失时导致心哀的重要原因。材料与方法材料与方法实验动物及材料.实验动物/雄性小鼠周,体重约?,共只。 新生大鼠天共只。由南方医科大学实验动物中心提供。.主要实验试剂/,美国胎牛血清,美国,单丹磺酰尸胺,美国,美国,美国化学发光液,提取试剂盒,美国

29、,日本 试剂盒,日本,美国、抗体、一、抗体公司,美国;凋亡试剂盒 ,中国钙黄绿素,美国一,美国蛋白定量试剂盒博士德,中国标记的抗兔二抗,主要试剂的配制磷酸盐缓冲液 ,:在蒸馏水中溶解博士学位论文、. 和.、. ,用调节溶液的值至.,加水定容至,在高压下蒸气灭菌,保存于室温。.乙酸缓冲液:碱,./冰乙酸.,./.加蒸馏水至。,加入双蒸水,。保存一周。最好现用%过硫酸铵:.现配。配制:碱,./冰乙酸.,./.加蒸馏水至。.,?配制:取 .溶解于单蒸水,定容至.,充分混匀。,加入胶原消化液:胶原酶, ,溶于?液,用孔径为.滤器过滤后即配即用。缺氧液:., .,? ., .,.,加双蒸水定容为.,乳酸

30、钠.,用双蒸水溶解,调整,高压灭菌于保存。复氧液:., ., .,? .,., ., .,葡萄糖.,用双蒸水溶解,调.,加双蒸水定容为,高压灭菌于保存。整主要实验仪器冷光源广州奥元仪器公司,中国小动物呼吸机公司,美国多导生理记录系统埃德公司,澳大利亚于术显微镜广州奥元仪器公司,中国高清摄像系统,日本多光谱微孔板阅读器 ,材料与方法倒置荧光显微镜,微量/定量仪、水平琼脂糖凝胶电泳仪和恒温水浴箱,瑞典;干转膜仪,美国荧光定量仪,美国图像工作站,美国;凝胶成像分析仪,法国;一,德国;超声仪 超净工作台苏州净化仪器厂,中国;二氧化碳孵箱 ,德国;低温高速离心机,美国;,瑞典;半干转膜仪一高压火菌器 .

31、,日本;台式计 ,美国;制冰机 .,;超纯水制备系统,英国;缺氧装置,;显微外科于术器材、。实验方法.原代心肌细胞的分离和培养新生大鼠,%酒精消毒,用眼科剪从剑突下沿胸骨左缘剪开胸廓,用眼科镊取出心脏,于?液中漂洗三次,将血液漂洗干净,轻轻将心脏撕裂.次,裂而不断的程度即可。将心脏转移至血清瓶,按每个心脏.加入 .%胰酶/,于过夜。往过夜消化的心脏中加入含%胎牛血清/每个心脏.,博士学位论文置于。恒温摇床,。弃上清,加入配制的胶原酶消化液每个心脏.,置于恒温摇床,。弃上清,加入胶原酶消化液每个心脏.,置于。恒温振荡器上搅拌,将上清转移到无菌试管中。上清即为含心肌细胞的混悬液。重复步骤次。将上清

32、离心。将上清分种在直径的培养皿中平均每.个心脏消化的细胞接种个平皿,。,%常规细胞培养箱中。此时%成纤维细胞及少量心肌细胞贴壁生长。将含心肌细胞的上清转移至无菌试管中,并用含%胎牛血清/漂洗.次,以充分回收心肌细胞。将细胞计数后按实验需要分别接种激光共聚焦小皿、孔板及孔板。.实验将分离的乳鼠心肌细胞按接种子孔板,培养小时后用含%胎牛血清的/换液,继续培养小时。分离的原代心肌细胞培养小时后,用不含血清的/培养小时,分别加入不同浓度雷帕霉素和渥曼青霉素。培养后吸去培养基,漂洗次,加入缺氧液后置于含%氧气,%的细胞培养箱中分别培养、。在相应的时间点将孔板取出,吸去上清,加复氧液继续培养后更换为含%胎

33、牛血清/培养。孔板中加入,后去培养液,加入,震荡。用分光光度仪于波长处读取值,以加有培养液的空白孔为对照。材料与方法重复上述实验次,取次测得的实验值进行统计分析。.检测心肌细胞自噬将分离的乳鼠心肌细胞按/皿接种于激光共聚焦小皿,培养小时后,用含%胎牛血清的/换液,继续培养小时。去培养基,用不含血清的/培养小时,去培养基,加入缺氧液后置于含%氧气,%的细胞培养箱中分别培养、。去缺氧液,加复氧液继续培养后,加入.州,。孵育。加入漂洗次。%多聚甲醛固定。漂洗次在倒置荧光显微镜下,用.波长激发光观察细胞内的自噬颗粒,软件分析结果。并用. 检测细胞凋亡取洁净盖玻片在%/醇中浸泡分钟,无菌超净台内吹干或用

34、无菌的或.%等溶液洗涤三遍,再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内,种入细胞培养过夜,使约为%一%满。刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入.固定液,固定分钟或更长时间可。过夜。去固定液,用或.%洗两遍,每次分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动。加入. 染色液,染色分钟。也宜用摇床,或于动晃动数次。博士学位论文去染色液,用或.%洗两遍,每次分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或于动晃动。滴一滴抗荧光淬火封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,让细胞接触封片液,尽量避免气泡。荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长左右,发射波长寿右。.流式细胞术检测心肌细胞线粒体通透性转换孔开放将分离的

35、乳鼠心肌细胞按/接种于直径为 ,培养小时后,用含%胎牛血清的/换液,继续培养小时。加入雷帕霉素和渥曼青霉素培养,去培养基,用洗次。设常氧对照组,缺氧组心肌细胞加入缺氧液,将心肌细胞缺氧孵箱中培养、。更换复氧液,%常规细胞培养箱中。去复氧液,漂洗次,先后加入钙黄绿素、氯化钴,。漂洗次。加入.%胰酶/ 室温放置约,显微镜下观察到大多数贴壁心肌细胞漂浮起来。加入.含有%胎牛血清的/,用吸管轻轻将贴壁心肌细胞管。吹打起来,转移到.离心。用.重悬心肌细胞,混匀后,取加入到孔板中,用流式细胞仪进行检测。.激光共聚焦检测线粒体通透性转换孔开放材料与方法将分离的乳鼠心肌细胞按./接种于激光共聚焦玻底小皿,培养

36、小时后,用含%胎牛血清的/换液,继续培养小时。加入雷帕霉素和渥曼青霉素培养,去培养基,用洗次。设常氧对照组,缺氧组心肌细胞加入缺氧液,将心肌细胞缺氧孵箱中培养、。更换复氧液,%常规细胞培养箱中。去复氧液,漂洗次,先后加入钙黄绿素、氯化钴,。漂沈次。激光共聚焦显微镜检测钙黄绿素的荧光,激发光,发射光。软件分析其荧光强度。用.激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位本研究采用.探针来指示线粒体膜电位。.是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时,.聚集在线粒体的基质中,形成聚合物,可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,.不能聚集在线粒体的基

37、质中,此时.为单体,可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。将分离的乳鼠心肌细胞按./接种于激光共聚焦玻底,培养小时后,用含%胎牛血清的/换液,继续培养小时。加入雷帕霉素和渥曼青霉素培养,去培养基,用洗次。设常氧对照组,缺氧组心肌细胞加入缺氧液,将心肌细胞缺氧孵箱中培养、。博士学位论文更换复氧液,%常规细胞培养箱中。去复氧液,漂洗次,先后加入.荧光探针,。漂洗次。激光共聚焦显微镜检测钙黄绿素的荧光,激发光波长为,发射光波软件分析其两种荧光的强度,长为绿光和红光。用计算/比值。.小鼠心梗及心肌缺血一再灌注模

38、型的建立/雄性小鼠,.周龄,.。随机分为如下组:假手术组;假手术雷帕霉素组;假手术渥曼青霉素组;/ 缺血时间雷帕霉素组;/ 渥曼青霉素组;,再灌;/缺血时间,再灌;/雷帕霉素组;/渥曼青霉素组;心梗组缺血;心梗雷帕霉素组:心梗渥曼青霉素组。对于药物治疗组,术前腹腔注射雷帕霉素./或渥曼青霉素./。图.小鼠心肌/模型的建立和实验设施/ . .模型建立见图:戊巴比妥钠麻醉/,将小鼠四肢及头部固定在手术台上,气管插管,接小动物呼吸机辅助通气,次/分钟,潮气量材料与方法.。用银针探头接小鼠右上及双下肢,连接生理记录仪,记录心电图。脱去其左侧胸部毛,%酒精消毒手术区,从第肋间处水平横行剪开皮肤、胸大肌、

39、前锯肌及肋间肌肉,暴露小鼠心脏,将小鼠改为右侧卧位。钝性剥开心包膜及胸腺,暴露左心耳及左心室,用.无损伤线于左心耳中部、下缘进针,右/处出针。对于缺血.再灌注模型,可将一直径约.光滑小珠置于结扎区,扎活结,心电图上见段抬高,结扎心肌变白即为成功。缺血预定的时间后将活结松开;对于心梗模型,可直接系死结结扎。假手术组开胸及心脏穿线,但不打结。动物术后处死,从心脏取血,离心,取上清后置于.保存以检测乳酸脱氢酶;心脏组织于液氮速冻后转移至.保存以提取和蛋白用,对于用于制作石蜡切片的心脏组织需先用预冷的约从左心室心尖处注入以洗净血液,然后将心脏置于%中性甲醛固定.。. 染色检测心肌细胞梗死区戊巴比妥钠麻

40、醉小鼠,气管插管,呼吸机辅助通气,方法同前。从剑突下剪开小鼠上腹部皮肤,钝性分离膈肌,从腋中线处剪开双侧肋骨至第肋,钝性分离皮下及心包以充分暴露左、右心耳及心室。迅速取下心脏,于冰预冷的中漂洗干净。.速冻,用刀片从心尖开始至左心耳处沿与纵轴垂直的方向切成厚度约. 片。将切片的心脏置于%中,。显微相机照相,用 软件计算左心室 ,和,灰白色区面积。心肌梗死区面积占左室面积百分心肌梗死区比。.乳酸脱氢酶测定于孔板中分别加入待测血清,然后各.抗.抗体、链酶亲和素.;空白对照孔不加样品,生物素标记的抗抗体,链霉亲博士学位论文和素.,只加显色剂和终止液,其余各步操作相同;标准品孔中只加,盖上封板膜,轻轻振

41、荡混匀,温育。入标准品,链霉素.揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置秒后弃去,如此重复次,拍干。每孔先加入显色剂,再加入显色剂 ,轻轻震荡混匀,避光显色。每孔加终止液,终止反应此时蓝色立转黄色。以空白空调零,波长依序测量各孔的吸光度值。根据标准品的浓度及对应的值计算出标准曲线的直线回归方程,再根据样品的值在回归方程上计算出对应的样品浓度。.心肌细胞总蛋白的提取弃细胞培养液,。预冷的漂洗次;加入裂解液含,:,其中直径的力裂解液,冰上放置,用塑料小刮刀将贴壁心肌细胞剥离下来。将裂解液转移至. 管,置冰上,每混匀次。将裂解液,离心。管中,保存。取上清分装于.心肌组织总蛋白的提取将心脏取下

42、后置于 管中,加入 裂解液含,:,尽可能剪碎心脏。用电动匀浆器于冰上匀浆心肌组织次,每次,间隔。将裂解液,离心。取上清分装于. 管中,.保存。材料与方法.法测蛋白浓度方法参照说明书按:的体积比加入试剂和,充分混匀以配置工作液。将冻干标准品用稀释成/的储存液,从高浓度到低浓度分别稀释为下列浓度:/、./、/、肛/、/、嵋/、。取标准品和样品加入孔板加入工作液,充分混匀,孵育。用酶标仪于波长处测值,根据标准曲线计算出蛋白浓度。.检测自噬及凋亡相关蛋白参照文献配制%分离胶和%浓缩胶,在加样孔中缓慢加入约样品蛋白,接通电源,先以的电压电泳,待样品进入分离胶后将电压调至/,直至溴酚蓝指示剂接近凝胶底部。

43、取出凝胶,去浓缩胶,参照说明书用 进行转膜,电压,转膜时间。用配制%封闭液,将膜浸入封闭液中,室温下平缓摇动。弃封闭液,用轻轻漂沈次。将一抗按相应的比例用含%稀释,将膜至一抗液中,过夜或室温孵育。漂洗次,每次。将膜转移至用含%液稀释的羊抗兔二抗中稀释比例:,室温下平缓摇动孵育。漂洗次,每次。用滤纸将膜上液体吸干,于暗室中将 的、试剂按:混合,把混合液轻轻滴在膜上,使液体铺满整张膜,室温下孵育。吸去膜上多余液体,用摄像系统拍照。 软件分析蛋白的灰度值,半定博士学位论文量蛋白的表达水平。.细胞和心肌组织的电镜取材固定.细胞的取材与固定分离的心肌细胞按./接种于直径为平皿中,按照缺氧时间和用药分组处

44、理同前。缺氧/复氧处理后,倒掉培养基,预冷漂洗次。用细胞刮子将细胞刮下,离心。小心去上清,加入戊醛固定液于冰箱保存。上述实验重复次,分别取材送电镜检查。.细胞的取材与固定动物分组处理同前,每组只。动物爪处理后麻醉同前,接呼吸机辅助通气。从剑突下剪开皮肤和胸腔,暴露心脏。用注射器将预冷 由心尖注入心室内,将心脏内血液冲洗干净。取出心脏,小心剥离心包和心耳,于中漂洗。取梗死区与正常心肌组织交界区心肌,用刀片切成约 长条。戊二醛固定液固定,放置冰箱内至送电镜检查。统计学分析计量数据以均数标准误表示,统计分析采用 .软件完成,多重比较采用?,两两比较采用法。计数资料用卡方检验。.被认为有统计学意义。结

45、果结果.随着缺氧时间延长,心肌细胞自噬逐渐增强将心肌细胞分别进行、缺氧,然后复氧。分别用染色, 检测自噬相关蛋白以及电镜分析等方法来检测心肌细胞自噬活性。.染色结果爷一图.检测结果 .:. .?:,. . / 士.拳.,”. ,. / .可以和自噬体上的酸性物质结合,在荧光显微镜下发出为蓝色荧光,在自噬形成的时候会聚集成团块状。由图可见,随着缺氧时间延长,心肌细博士学位论文胞自噬颗粒的面积和数量均增多,表明随着缺氧时间延长,心肌细胞自噬活性逐渐增强.。表 染色检测缺氧.复氧心肌细胞自噬活性均数标准误 / 木. . . /. /,砌. ,. .自噬相关蛋白表达水平用免疫印迹的方法检测自噬相关蛋白

46、和的表达,结果发现这两个蛋白的表达水平均随缺氧时间延长而逐渐上调图。. 盈氓垤.。 , 。?一,.川舵徽湍 川妯附阱 ?,?,?,?,譬矗。.厶一。皇一。厶 图.“自噬相关鱼白的表达水下上凋. .:.: ,.。.,./. . / ,愀. , .结果表缺氧.复氧对自噬相关蛋白和 表达的影响均数标准误” /. . . /. /,恹. ,. ,.电镜观察下自噬水平随着缺氧时间延长,细胞中自噬颗粒增加。当缺氧时间延长为时,心肌细胞中自噬囊泡数量双层膜结构也随之增加,线粒体损伤加重图。表电镜检测缺氧.复氧对心肌细胞自噬泡形成的影响均数标准误 . / /. . .;肇. ;. .博士学位论文, 帆 ,麟弓嚣滠蘼鬻 引。. 翳参.一.疗一一?石一.:一%疗口。一。昂。一?舟、爪 瓜 /图.随着缺氧时间延长,自噬囊泡增加第一行,线粒体损伤加重第行。 . ?: ?/.:.:.: .:.: . .:;. / . /尸.;&. .自噬调节剂对自噬相关蛋白的影响我们验证了自噬增强剂雷帕霉素和自噬抑制剂渥曼青霉素对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响。如图所示,雷帕霉素显著上调而渥曼青霉素则下调之。