cDNA文库与EST序列分析.ppt

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1、cDNA文库构建及EST序列分析,陈威、丁立建、黄显军、刘振英、毛海花、上官巧灵、朱竹君 （按姓氏首字母排列，排名不分先后）,组员任务分配,陈 威：统筹安排、资料收集 丁立建：cDNA文库应用、资料收集 黄显军：背景简介 刘振英：cDNA文库构建原理、资料收集 毛海花、上官巧灵、朱竹君：EST序列分析,目录,一、背景简介 二、cDNA文库构建原理 三、cDNA文库的应用 四、EST序列分析 五、参考文献,cDNA文库构建及EST序列分析背景简介,黄显军,cDNA基因文库： 某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。,1. cDNA文库背景简介

2、,1.1 cDNA文库产生前的技术概况 随着生物及信息技术的迅速发展，寻找新基因、克隆新基因、进而研究基因的功能已成为功能基因组研究中的一项重要工作。 在过去寻找新基因的方法有： a）消减杂交 b）mRNA 差异显示 c）cDNA 的代表性差异显示分析法 d）差异消减展示等方法 这些方法在新基因的发现方面都各有其独特的优势，可寻找出一些差异表达序列，但这些差异表达序列大部分情况都是不完整的基因。,1.2 cDNA文库的产生 由于以前技术的缺点，目前，比较可行而且应用较多的方法主要是 cDNA 文库的筛选。 一方面 cDNA 文库只代表一定时期一定条件下正在表达的基因，是整个真核基因组中的少部分

3、序列，因此 cDNA 克隆的复杂程度比直接从基因组克隆的要小得多。 另一方面由于每个 cDNA 克隆只代表一种 mRNA 序列，因此在基因克隆过程中出现假阳性的概率比较低。 所以 cDNA 文库的构建已成为当前分子生物学研究和基因工程操作的基础。,1.3. 为什么要构建cDNA文库？ cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。,1.4. 怎么构建cDNA文库？,1.5. cDNA文库构建后能干什么？ 1)可保护濒危珍惜生物资源 2)可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针 3)可以用于分离全长基因进而开

4、展基因功能研究,1.6. cDNA文库的优势及价值 1）优势：cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势。 2）价值：在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。,2. EST序列分析背景简介,克隆全长cDNA序列的传统途径： a)噬斑原位杂交的方法 b)采用PCR的方法 缺点：工作量大、耗时、耗材 这些传统方法已满足不了人类基因组时代迅猛发展的要求。,2.1. EST序列分析的产生,随着人类基因组计划的开展，在基因结构、定位、表达和功能研究等方面都积累了大量的数据

5、，如何充分利用这些已有的数据资源，加速人类基因克隆研究，同时避免重复工作，节省开支，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前。 采用生物信息学方法延伸表达序列标签（ESTs）序列，获得基因部分乃至全长cDNAycg，将为基因克隆和表达分析提供空前的动力，并为生物信息学功能的充分发挥提供广阔的空间。,2.2. EST技术的作用价值,EST技术最常见的用途是基因识别，传统的全基因组测序并不是发现基因最有效率的方法，这一方法显得即昂贵又费时。因为基因组中只有2%的序列编码蛋白质，因此一部分科学家支持首先对基因的转录产物进行大规模测序，即从真正编码蛋白质的mRNA出发，构建各种cDNA文库，并对库

6、中的克隆进行大规模测序。 Adams等提出的表达序列标签的概念标志着大规模cDNA测序时代的到来。虽然ESTs序列数据对不精确，精确度最高为97%，但实践证明EST技术可大大加速新基因的发现与研究。,目录,一、背景简介 二、cDNA文库构建原理 三、cDNA文库的应用 四、EST序列分析 五、参考文献,cDNA文库的构建, 刘振英,为什么构建cDNA文库,真核生物基因结构原核生物有很大差异。 真核生物的基因不能直接在原核生物中表达 ,只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），并连接相应的原核细胞表达控制元件，才能在原核生物中表达。 mRNA的不稳定性 真核细胞的基因通常只有

7、一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，因而对真核基因的表达和相关的mRNA研究，一般都是通过对cDNA的研究来进行。,But如何构建cDNA文库,LOGO,mRNA的分离制备,寡聚胸苷酸oligo(dT)纤维素或琼脂糖亲和层析法，在高盐缓冲溶液中poly(A)RNA与oligo(dT)结合，低盐缓冲溶液使它们解离。,LOGO,cDNA 第一链的合成,Oligo（dT）引导的 cDNA 合成 高浓度的Oligo（dT）引物与 mRNA 的 3 末端的 poly（A）配对。 优点：逆转录反应基本被限定在以mRNA为模板，故即使样品中混有少量的rRNA时不会影响cDNA文库构建的质量。 缺点：只

8、能从mRNA3末端其起始引发cDNA的合成，由于逆转录酶的能力有限，平均合成出的cDNA长度在1kb以下，因此合成cDNA 通常会缺少mRNA5端的重要信息。,LOGO,随机引物引导的 cDNA 合成 采用 610 个随机碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的 5-端序列。 优点：克服了oligo(dT)合成cDNA时缺少5-端序列的缺点， 能更有效的反映出表达mRNA全长的序列信息。 缺点：对mRNA样品的纯度要求苛刻。,cDNA 第二链的合成,自身引导法

9、置换合成法 PCR法,LOGO,方法一：自身引导法,LOGO,方法二：置换合成法,方法三：PCR法,cDNA的克隆,（1）修饰cDNA两端 （2）cDNA与载体相连 （3）导入宿主细胞: 重组体在一定条件下导入宿主细胞培养或保存宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆体，以保证它们的遗传性状相同。,LOGO,来，看个cDNA文库构建的视频吧,cDNA文库构建的其他方法,固相cDNA文库 1998年，由Roeder开发的一种快速高效的cDNA文库构建方法。 它基于传统的cDNA文库合成方法，包含通常所需的全部步骤。但在cDNA合成过程中引入了固相支持物。cDNA通过一个生物素基固定在链霉卵白素偶联的磁珠

10、上，这样在反应中就可以简便而迅速的实现酶和缓冲液的更换，因此它将快速与高质量的文库结合在一起(构建文库只需一天)，并且构建的文库适合于大多数的研究目的。,优点：可以简便cDNA合成的操作。在进行缓冲液更换时既没有cDNA的丢失之忧，也无其他物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真实的代表性文库，它包含有短小的cDNA，这是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总之，固相法结合了传统的cDNA合成的优点并弥补了其不足。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量。,差示cDNA文库 差示文库又称为扣除文库，是反映不同组织和细胞或同一细胞在不同功能状态下，基因表达差异的cDNA文库。主要用于研究细胞的发

11、育、分化、细胞周期、细胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾病的研究。 基本流程：分别提取不同组织细胞或同一种细胞在不同功能状态下细胞的mRNA，将其中一种细胞的mRNA反转录成cDNA第一链，然后将该cDNA与另一细胞过量的mRNA进行杂交，第一种细胞中若存在不同于第二种细胞的特殊基因，则会产生特殊基因的mRNA和cDNA，它们不能与第二种细胞的mRNA形成杂交体。将未形成杂交体的cDNA分出，合成与之互补的cDNA第二链，再以此双链cDNA构建cDNA文库，即差示文库。,标准cDNA文库 染色体或区域特异性cDNA文库 限制性cDNA文库 0ligocapping方法构建cDNA文库,丁

12、立建,研究背景：,中国是大豆的起源地,已有 4 000 多年的栽培历史,研究和利用大豆基因资源具有特殊的意义。本研究以栽培大豆为材料,通过干旱和低温处理,构建cDNA融合表达文库,为今后分离抗逆相关基因和分子育种工作奠定了基础。,材料：,栽培大豆(Glycine max)品种为吉林35 ; 大肠杆菌菌株DH5和酵母菌株 YM4271 ; 用于构建文库的试剂盒(购自 Strata gene公司) ; 提取总 RNA 的 Trizol 试剂盒(购自 Invitrogen公司) ; 限制性内切酶、 T4连接酶、 DNA片断回收试剂盒(均购自大连宝( TaKaRa )生物工程公司) 等,方法与步骤：,

13、大豆处理,低温处理:将上述植株置于4 冰箱中,处理4 h ;,干旱处理:将上述植株置于恒温箱中,25 下处理4 h,结果与分析,总 RNA与mRNA的质量检,cDNA文库插入片段长度的 PCR分析,三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一 ,近年来养殖病害呈逐年上升趋势 ,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因 ,研究其免疫基因的功能和免疫机制 ,构建了三疣梭子蟹血细胞全长 cDNA文库可以提供三疣梭子蟹病害防治理论基础 。为深入研究免疫相关基因的功能和免疫机制奠定基础。,研究背景：,1、三疣梭子蟹采自浙江海域; 2、总 RNA提取 Trizol试剂盒 ( T

14、rizol Plus RNA Purificati on Kit)与mRNA分离试剂盒 ( FastTrack 2 . 0Kit)购自 Invitrogen公司; 3.、SMARTTMcDNA Library Construction Kit与Advantage 2 PCR Kit购自Clontech公司; pGEM2 T easy T载体购自 Promega公司。其余试剂均为进口或国产分析纯试剂。,材料：,FastTrack 2 .0Kit试剂盒，通过 poly( T)纤维素柱进行亲和层析 ,从三疣梭子蟹血细胞总 RNA中得 poly A+mRNA。,成年雄性三疣梭子蟹采集后饲养于恒温水族箱

15、 ( 25 ),取 1只蟹收集血细胞,采用Trizol试剂盒提取三疣梭子蟹血细胞总 RNA,.1.2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定 ,同时测定 OD260和 OD280值 ,分析所提取 RNA的浓度和纯度。,方法：,cDNA文库的质量鉴定与随机测序,文库滴度的鉴定,文库重组率及平均插入片段的鉴定,部分序列测定及分析,总 RNA电泳分析,方法：,克隆插入片段的 PCR检测,丁立建,EST序列分析,原理 方法 应用,毛海花、上官巧灵、朱竹君,ESTs（ExpressedSequencetags）是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5末端或3末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约

16、60500bp的一段cDNA序列。,BACK,原理,分析EST序列的目的 获得EST序列的方法 分析EST序列的方法 如何提交EST序列,BACK,方法,分析EST序列的目的,基因识别 获得全长cDNA 研究基因可变剪接类型 SNP的发现 表达量比较,application,BACK,获得EST序列的方法,从数据库下载 dbEST www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/ CGAP http:/cgap.nci.nih.gov/ UniGene www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/ Tigr Gene Index www.tigr.org/tdb/tgi/

17、cDNA文库测序,BACK,分析EST序列的方法,EST分析流程,1. Raw EST,从cDNA文库随机挑取单一克隆进行5或3端测序； 测序方向的选择，根据不同的实验目的选择不同的测序方向： 5端 5上游非翻译区校短且含有较多的调控信息。一般在寻找新基因或研究基因差异表达时用5端EST较好，大部分EST计划都是选用5端进行测序的，而且从5端测序有利于将EST拼接成较长的基因序列。 3端 3端mRNA有一20200bp的plyA结构，同时靠近plyA又有特异性的非编码区，所以从3端测得EST含有编码的信息较少但研究也表明，10的mRNA3端有重复序列，这可以作为SSR标记；非编码区有品种的特异

18、性，可以作为STS标记 两端测序 获得更全面的信息。,2. Pre-processing,去除低质量的序列（Phred） 应用BLAST、RepeatMasker或Crossmatch遮蔽数据组中不属于表达的基因的赝象序列(artifactualsequences) 载体序列(ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/repository/vector) 重复序列(RepBase, http:/www.girinst.org) 污染序列(如核糖体RNA、细菌或其它物种的基因组DNA等) 去除其中的镶嵌克隆。 最后去除长度小于100bp的序列。,镶嵌克隆的识别,Backtobackpoly(A

19、)+tails Linkertolinkerinmiddleoftheseq-uence Blastn/Blastxsearch,3. Clustring,聚类作用： 产生较长的一致性序列(consensussequence)，用于注释 降低数据的冗余，纠正错误数据 可以用于检测选择性剪切 ESTs聚类的数据库主要有三个： UniGene(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene) TIGRGeneIndices(http:/www.tigr.org/tdb/tgi/) STACK(http:/www.sanbi.ac.za/Dbases.html),聚类的目的就是

20、将来自同一个基因或同一个转录本的具有重叠部分(overlapping)的ESTs整合至单一的簇(cluster)中。,常用的拼接软件, Phrap http:/www.genome.washington.edu/UWGC/analysistools/Phrap.cfm CAP3(XiaoqiuHuang, huangmtu.edu) d2_cluster(http:/www.sanbi.ac.za/),错拼漏拼的原因,错拼 3断polyA尾巴的存在 镶嵌clone的存在 重复序列 漏拼 拼接参数太严格 重复序列 镶嵌clone,解决方法,调整拼接参数 EST和consensus进行对比 根据注

21、释结果来判断,4. Cluster的连接,利用cDNA克隆的信息和5，3端Reads的信息，不同的Cluster可以连接在一起。,5. 基因注释,注释： 序列联配，一级序列同源对比 Blastn，Blastx 蛋白质功能域搜索(二结构比对)，蛋白质结构域和功能位点预测 Pfam Interpro,后续分析,比较基因组学分析 基因表达谱分析 新基因研究 基因可变剪切分析 实验验证 MicroArray GeneChip RTPCR Northenbloting,BACK,如何提交EST序列,提交至dbEST 发邮件至batch-subncbi.nlm.nih.gov 准备以下文件 a. Publ

22、ication b. Library c. Contact d. EST,back,应用,Goal,研究背景,1995年，Fanco首先应用EST法对曼氏血吸虫(Sm) 的基因进行了分离和序列测定。到目前为止( 1999.5)，在NCBI的GenBank中已收录的血吸虫EST序列9737条，其中Sm有8216条，日本血吸虫(Sj) 有834条，分别占GenBank中已收录的 Sm 和Sj 基因序列的94.26和86.60。尽管目前对SmEST的分离与测定进展迅速，但已知Sj EST序列只占Sj表达基因数的4.17，所以继续开展日本血吸虫编码基因的分离和序列测定仍具有重要的意义。,材料,日本血吸

23、虫（中国大陆株）成虫cDNA文库由南京医科大学陈淑贞教授构建。该文库系采用定向克隆构建于 gt 11/1090系统中，所构建的基因表达文库容量为3.13106重组子。,方法,结果与分析,重组克隆的分离及P C R鉴定,未知基因 EST序列的确认,获得新基因EST序列进入NCBI的序列进入编号，其序列编号分别为 A I 7 2 5 3 5 7 、AI 7 2 5 3 6 0 、AI725 3 6 1和 AI 7 4 0 1 8 9A I 7 4 0 2 0 4,参考文献,1 沈倍奋分子文库北京：科学出版社，2001. 2 赵亚华分子生物学教程.北京：科学出版社，2004 3 P.c.特纳等分子生物学北京：科学出版社，2001 4朱利军,长孙东亭,罗素兰. cDNA文库在药用海洋生物研究中的应用J.中国海洋药物杂志, 2009, 28(1):53-58. 5王庆胜.我国cDNA文库研究现状J.黑龙江农业科学, 2009(1):3-4. 6吴忠道，余新炳，郑亦男等日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的分离和EST序列测定J中国人兽共患病杂志，2000,16(1):3-6,LOGO,