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1、植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测,植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测,脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。,背景知识,核酸的存在形式,DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。
2、在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。,核酸的理化性质,细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸,基本过程,机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；化学试剂法：用SDS处理细胞；酶解法：加入溶菌酶，破坏细胞壁。,细胞破碎,SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂,细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,SDS能够破坏这种价键。CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。,DNA提取,蛋白质常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。RNA常选用RNase消化，或是用Li
3、Cl来消除大分子的RNA。酚类物质提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。多糖提取液中加1PVP。,DNA纯化（去杂质）,实验材料新鲜蔬菜叶片(去叶脉)试剂2CTAB抽提液TE缓冲液(pH=8.0)氯仿：异戊醇(24:1),材料与试剂,离心机水浴锅研钵微量移液器,仪器用具,移液器量程的选择,1取2g清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加1/3药匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。2将1mL研磨液转入1.5mL离心管中，置于65水浴中保温20min，其间颠倒混匀23次。破碎细胞3.12000r/min离心5min，取上清液700L转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充
4、分颠倒混匀。12000r/min，离心5min。抽提去蛋白4将上清液移入新的1.5mL离心管内，加600L异丙醇。颠倒混匀，可见DNA絮状沉淀。沉淀核酸512000r/min，离心1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。将沉淀回溶于20LTE缓冲液待测。,操作步骤,1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料；3）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。,注意事项,DNA分
5、子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。,电泳原理,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,仪器和试剂,仪器电泳仪电泳槽灌胶模具等,Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）,常用电泳缓冲液,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,溴化乙锭（EB）是一种荧光染料，EB分子可
6、嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。,核酸染色剂,注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,DNA分子量标准,不同种类DNAMarker,1.凝胶制备制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入20mL0.5TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60时，加入EB至终浓度0.5g/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。2.加样取10lDNA样液与2l上样buffer混匀，用微量移液器小心加入样品槽。3.电泳接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。4.观察拍照,四、操作步骤,1.结合原理，简述CTAB法分离提取植物总DNA的基本过程。2.为了获得高质量的植物总DNA，在分离提取过程中应注意那些问题？,What?!How?!,思考,
植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测.ppt
