7.检验程序确认和验证

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1、检验程序确认和验证（2）测量区间定义 measuring interval 又称工作区间 working interval 在规定条件下，由具有一定测量不确定度的测量仪器或系统能测出的一组同类量的量值（VIM）。注1：在某些领域，也称“测量范围”。注2：测量区间下限不应与“检出限”相混淆。线性、线性范围定义 线性：linearity 指待测标本中能直接按比例关系给出分析物浓度结果的能力。注1：线性代表整个测量系统的反应。注2：一个测量系统的线性由不同已知浓度的分析物测定得到。 线性范围：linear range 指测量系统所能覆盖的可接受线性范围，非线性误差小于设定标准。分析测量范围定义lan

2、alytical measurement rangel患者标本未经任何处理（稀释、浓缩或其他预处理），由测量系统直接测得的可靠结果范围，在此范围内，一系列不同标本分析物测量值与实际浓度呈线性关系。临床可报告范围定义lclinical reportable rangel 是定量检测项目向临床能报告检测范围，患者标本可经稀释、浓缩或其他预处理。区别线性评价-CLSI文件 EP6-A，Evaluation of the Linearity of Quantitative MeasurementProcedures，2003 EP10-A3，Preliminary Evaluation of Quan

3、titative Clinical Laboratory Measurement Procedures，2006EP6-A方案和要求1.设备熟悉阶段 检验人员应熟悉检测系统的操作、正确的质控和校准、恰当的标本制备。2.线性评估实验 实验室验证厂商声明：57个浓度*重复2次。 厂商建立新方法：911个浓度*重复24次。 实验室改良已建立的方法：79个浓度*重复23次。 时间：最好一天内完成。EP6-A方案和要求 样品准备：可接受的基质1.病人混合标本：1份标本的分析物浓度应接近可报告范围上限，另1份标本的分析物浓度应接近检出限。2.用推荐稀释液稀释病人混合标本：标本中分析物浓度应为高浓度，稀释液

4、应按厂商推荐。3.病人混合标本添加分析物：若没有干扰的话，含分析物的添加物无需高纯物质。4.病人混合标本用低浓度经处理的材料稀释或经处理的混合材料稀释。5.商品质控品/校准品/线性材料。6.病人混合标本用生理盐水或其他稀释液稀释。7.不稀释或过度稀释的商品质控品。8.水溶液。EP6-A方案和要求 实验要求测量顺序：应随机。如存在明显携带污染或漂移，选择对后续标本影响最小的顺序进行。分析范围：应接近或等于最低和最高厂商声明的性能范围。EP6-A方案和要求 样品制备：足量混合血清。X1：低值混合血清。X2：3份X1+1份X5。X3：2份X1+2份X5。X4：1份X1+3份X5。X5：高值混合血清。

5、更多水平： X4+X1 、X3+X2 、X2+X3 、X1+X4。EP6-A方案和要求 数据处理和分析：1.初步数据检查有无极端明显差异或错误；X-Y图上有无离群值；每组数据有无漂移或趋势性变化。2.离群值检查单个测定结果明显偏离其他检查结果；单个离群值可删除，不用增加数据；提示存在非线性或系统误差。3.确定分析测量范围作一元一次（直线）、二次（抛物线）或三次（S形）多项回归分析。阶别 回归方程 自由度一次 Y=b0+b1X 2二次 Y=b0+b1X+b2X2 3三次 Y=b0+b1X+b2X2+b3X3 4一元一次：直线，是判断某种方法是否为线性的最适方程。一元二次：抛物线，有增加趋势或减少

6、趋势。一元三次：S形，呈非线性，b2和b3做t检验证明非线性。4.非线性程度：计算线性偏差（DL）。用户定义线性程度要求或非线性允许误差范围，取决于偏移目标或测量误差。5.考虑随机误差是否因随机变异导致非线性，用方差来估计，即Sr。线性评价：Westgard混合物 记录 均值1 2 3X1（0） 6 6 6 6X2（25） 138 138 138 138X3（50） 278 277 279 278X4（75） 410 411 411 411X5（100）545 546 543 545混合物 均值(Y) 理论值(X) 偏倚 误差 X1 6 0（X3均值0） +6 N/A X2 138 139（X

7、3均值0.5） -1 -0.7 X3 278 278（X3均值） 0 0 X4 411 417（X3均值1.5） -6 -1.4 X5 545 556（X3均值2.0） -11 -2.0验证：临床可报告范围 实验方法：尚无公认方法。 实验结果与分析计算回收率：回收率=（实测值/预期值）*100%按厂商说明书要求判断结果。举例（最高） 稀释倍数 实测值 预期值 回收率1:10 6688.9 6688.9 100.01:20 7193.8 6688.9 104.91:100 7509.3 6688.9 112.31:200 7560.8 6688.9 113.0可报告范围上限：20*6688.9=

8、133778举例（最低）稀释倍数 实测值 预期值 回收率1:10 92.5 85.70 107.91:40 23.6 21.42 110.21:50 19.6 17.14 114.41:100 11.3 8.57 131.91:200 6.75 4.29 157.3可报告范围下限：85.70/5=17.14测量系统的灵敏度定义 sensitivity of a measuring system 简称灵敏度 sensitivity 测量系统的示值变化除以相应被测量的量值变化所得的商。 注1：测量系统的灵敏度可能与被测量的量值有关。 注2：所考虑的被测量值的变化必须大于测量系统的分辨力。检出限定义

9、 detection limit，limit of detection 在给定测量程序获得的测得值，其声称的物质成分不存在的误判概率为，声称物质成分存在的误判概率为。 注1：国际理论和应用化学联合会（IUPAC）推荐和的默认值为0.05。 注2：有时使用缩写词LOD。 注3：不要用术语“灵敏度”表示“检出限”定量检测限定义 l limit of quantitation，LoQl 在规定可接受精密度和正确度条件下，能定量测出标本中分析物的最小量。l 也称为确定低限、检测范围的低限。空白限定义 limit of blank，LoB 在规定可能条件下，空白标本被观察到的最大检测结果。 注：LoB不

10、是实际检测到的浓度，是在实际浓度处的阳性信号，同样，LoB是在规定可能条件下，含有分析物等于LoD水平样品的预期最低值。是检测下限、最小可检测浓度。概率分布曲线检出限评价-CLSI文件 EP17-A，Protocols for Determinationof Limits of Detection and Limits ofQuantitation，2004确认：EP17-A方案和要求 检测限（LoD）确认方案对某一检验项目，用空白标本和非常低浓度系列标本进行多次重复检测，得到各自结果。空白标本的检测结果：用于确定某个响应量的临界点，高于该临界点的值被认为含有分析物，即为阳性结果。该临界点结合

11、低浓度标本的标准差：用于确定可能的超过预期最高空白值的分析物浓度。EP17-A方案和要求空白限（LoB）： 在规定水平类错误和类错误。5 空白限（LoB）方法：空白值呈正态分布，空白限：LoBB+1.645BB：空白检测均值；B：空白检测标准差。空白值呈非正态分布，空白限：估计95%位数：PXNB(95/100)+0.5，LoB=PctB100-如：95，NB60，PX57.5，LoB（X57+X58）/2检出限（LoD）方法：一种为实际标本等于LoB；一种为实际标本浓度检测结果估计5位点等于LoB。LoDB+1.645B+1.645ss：低浓度标本检测均值；s：低浓度标本检测标准差。空白限&

12、检出限 实验标本来源：天然标本。 空白标本：应为去除组分的标本，如抗体沉淀、酶降解、活性炭吸附。 低浓度标本：配成有分析物标本，最好一组几个不同个体标本。数量：最好对5个以上标本。测定次数：标本数量越多，重复测定次数越多，估计的LoD越小，结果越可靠。 LoB测定步骤：建议至少60次测定，对1个或数个空白标本进行重复检测（NB）。 LoD测定步骤建议至少60次测定，对多个低浓度标本进行重复检测，浓度范围从LoB到4LoB之间，至少46个标本。举例LoD=LoB+1.645s=0.01+1.645*0.011=0.03 LoQ测定步骤：建议测定35个浓度标本，每个至少测定8次，共40个结果。计算

13、标准差和差值均值，总误差=偏移+2*s。若小于规定目标，则LoQ=LoD。LoBLoDLoQ。举例WBC：允许误差范围为15%。验证：EP17-A方案和要求 LoB、LoD测定步骤：使用厂商提供的LoB值（1份空白样品重复测定20次）和LoD值，不同天不同样品测定数据不少于20个；如有必要应验证LoB。 LoQ测定步骤：建议测定35个浓度标本，每个至少测定5次，至少25个结果。每个标本的测定结果与总允许误差目标进行比较，符合要求即可。定量结果报告图示 定量结果的报告：结果LoB：报告为不能检出。LoB结果LoD：报告为检出分析物，但浓度LoQ。LoD结果LoQ：报告为检出分析物，但浓度LoQ；

14、或报告结果，并告知有高不确定度的可能。结果LoQ：可直接报告结果。定性检验 定义：是仅给出阳性或阴性实验结果的试验。真正定性是基于唯一医学判定值；某些定性检验源于二分类定量或顺序等级。 分类：筛查试验（具有高敏感性以确保检出真阳性结果）；诊断试验、确认试验（具有高特异性以确保检出真阴性结果）。48定性检验评价-CLSI文件 EP12-A2，Protocols for Evaluation ofQualitative Test Performance，2008确认：EP12-A2方案和要求 实验熟练阶段：人员应熟悉和经培训，能正确掌握标本处理和保存、试剂处理和保存、实验操作、结果解释和质控操作。

15、 测定质控物：若使用厂商提供质控物时，应按厂商要求做质控。使用时应注意基质效应。在评价期间尽可能使用相同质控物。 新定性检验方法的性能评价1.重复性评价：评估检测方法精密度。2.方法学比较：2种或多种方法检测同一标本后比较检验结果。1.重复性评价l 内容：l 应提供标本浓度接近临界值结果，不宜用远低于或高于临界值浓度标本。l 在临界值95%区间外，定性方法给出相同测定结果的能力（阴性或阳性）是评价方法性能的重要指标。l 步骤：1.确定被评价方法的临界值（Cutoff）。方法：按检测试剂或系统说明书；如未知临界值：将阳性样本进行系列稀释，以确定能获得50阳性、50阴性结果的稀释度，此时标本浓度为

16、该法临界值。2.确定临界值20%的标本浓度范围是否在该方法临界值95%区间内。 重复性实验步骤：用于评价的临床标本应按要求采取，必要时，应新鲜采取，并尽快完成检验。在临界值基础上准备：-20%浓度样品、+20%浓度样品。对低、高浓度标本分别测定20次，记录阳、阴性结果数。 当+20%或-20%浓度样品产生阳性或阴性结果数95%，说明临界值20%浓度范围临界值95%区间，对被测物浓度在20%浓度范围外标本，实验方法将给出稳定的结果。 当阳性、阴性结果数95%时，应另外准备不同浓度实验标本，重新进行评价。2.方法学比较 采用同一组样品，同时用2种（实验方法和比较方法）方法测定，并对测定结果进行比较

17、。 比较方法：另一种定性方法。金标准方法。定量方法。临床诊断结果。“金标准”方法 是对某疾病诊断最可靠方法。通常为：病原学检查；细胞学检查；活体组织检查；尸检；特殊影像检查；长期随访结果；临床专家共同制定公认最新诊断标准。方法学比较 样品种类和数量新鲜临床标本：最好使用常规患者的新鲜标本，样品量应保证实验方法和比较方法测定的需要。样品中被测物应稳定。尽可能实验方法和比较方法同时完成测定。参考样品盘：为一组临床样品组成，常包含不同浓度被测物的临床样品，也可能包含干扰物质。测定结果与指定参考方法或临床诊断相联系，对评价定性实验非常有效。虽有优点，但不能反映患者实际分布情况和预测效果。 样品种类和数

18、量阴、阳性样品应分别至少需50例。在实际操作中，当阳性样品达到50例时，阴性样品可能已超过50例，但为了保证正确评价假阴性问题，必须保证有足够的样品量。 步骤：应在1020天内完成，保证：足够样品量；在常规条件下进行操作。全部样品应妥善保存，以备再次检测（如用比较方法再次测定、用另一种对比方法测定、用临床诊断信息解释实验问题）。在已知样品临床诊断结果的情况 临床诊断 合计阳性 阴性实验方法 阳性 A B A+B 阴性 C D C+D 合计 A+C B+D N 诊断灵敏性=A/(A+C)100% 是真实情况为有病时，试验发现疾病的能力 诊断特异性=D/(B+D)100% 是真实情况为无病时，试验

19、排除疾病的能力 诊断效率=(A+D)/N100% 阳性预测值=A/(A+B)100% 阴性预测值=D/(C+D)100% 相关样品患病率=(A+C)/N100%在未知样品临床诊断的情况 临床诊断 合计阳性 阴性实验 阳性 a真阳性 b假阳性 a+b方法 阴性 c假阴性 d真阴性 c+D合计 a+c b+d n 阳性符合率=a/(a+c)100% 阴性符合率=d/(b+d)100% 总符合率=(a+d)/n100%灵敏性和特异性可信区间 公式： 95%下限：100%（Q1-Q2）/Q3 95%上限：100%（Q1+Q2）/Q3 灵敏度： 特异度：举例：候选方法和诊断标准比较幽门螺杆菌诊断标准候选

20、方法阳性阴性合计阳性57 2 59阴性4 39 43合计61 41 102灵敏度57/61*100 93.40%特异度39/41*100 95.10%患病率61/102*100 59.80%阳性预测值PPV 57/59*100 96.60%阴性预测值NPV 39/43*100 90.70%举例 比较方法的灵敏度可信区间Q1 2*57+3.84 117.84Q2 1.96*3.84+4*4*57/61 8.496Q3 2*61+7.68 129.68lower limit (117.84-8.496)/129.68*100 84.30%upper limit (117.84+8.496)/129

21、.68*100 97.40%比较方法的特异度可信区间Q1 2*39+3.84 81.84Q2 1.96*3.84+4*2*39/41 6.632Q3 2*41+7.68 89.68lower limit (81.84-6.632)/89.68*100 83.90%upper limit (81.84+6.632)/89.68*100 98.7%旧方法和诊断标准比较幽门螺杆菌诊断标准 阳性 阴性 合计 阳性 54 7 61旧方法 阴性 7 34 41 合计 61 41 102灵敏度 54/61*100 88.50% 特异度 34/41*100 82.90%患病率 61/102*100 59.80

22、%阳性预测值PPV 54/61*100 88.50%阴性预测值NPV 34/41*100 82.90%旧方法灵敏度可信区间Q1 2*54+3.84 111.84Q2 1.96*3.84+4*7*54/61 10.487Q3 2*61+7.68 129.68lower limit (111.84-10.487)/129.68*100 78.20%upper limit (111.84+10.487)/129.68*100 94.30%旧方法特异度可信区间Q1 2*34+3.84 71.84Q2 1.96*3.84+4*7*34/41 10.196Q3 2*41+7.68 89.68lower l

23、imit (71.84-10.196)/89.68*100 68.70%upper limit (71.84+10.196)/89.68*100 91.50%候选方法、旧方法和诊断标准三者间比较-McNemar法方法结果总标本诊断标准候选方法旧方法阳性阴性阳性阳性阴性阴性阳性阴性阳性阴性apos+anegbpos+bnegcpos+cnegdpos+dnegaposbposcposdposanegbnegcnegdneg合计Nnposnneg例：幽门螺杆菌三种比较方法比较总标本诊断标准候选方法旧方法阳性阴性阳性阳性阴性阴性阳性阴性阳性阴性5546375341320534合计1026141诊断灵

24、敏度比较D (93.4-88.4)或(4-1)/61*100 4.90%Q1 (53+4)(1+3)(53+1)(4+3) 86184Q2 (53*3)-(4*1) 155Q3 Q2-n1/2 124.5Q4 Q3/Q1 0.4241Q5 (93.4-84.3)2-2*0.4241*(93.4- 84.3)*(84.3-88.5)+(94.3-88.5)2 71.68Q6 (88.5-78.2)2-2*0.4241*(88.5- 78.2)*(97.4-93.4)+(97.4-93.4)2 87.14D-Q5 4.9-71.68 -3.6D+Q6 4.9+87.14 14.2诊断特异度比较D

25、95.1-82.9 12.20%Q1 (2+0)(5+34)(2+5)(0+34) 18564Q2 (2*34)-(0*5) 68Q3 Q2-n1/2 47.5Q4 Q3/Q1 0.3486Q5 (95.1-83.9)2-2*0.3486*(95.1- 83.9)*(91.5-82.9)+(91.5-82.9)2 132.25Q6 (82.9-68.7)2-2*0.3486*(82.9- 68.7)*(98.7-95.1)+(98.7-95.1)2 178.96D-Q5 12.2-132.25 0.7D+Q6 12.2+178.96 25.6生物参考区间 5.5.2 生物参考区间或临床决定值

26、实验室应规定生物参考区间或临床决定值，将此规定的依据文件化，并通知用户。 当特定的生物参考区间或决定值不再适用服务的人群时，应进行适宜的改变并通知用户。 如改变检验程序或检验前程序，实验室应评审相关的参考区间和临床决定值（适用时）。生物参考区间定义l biological reference intervall 参考值分布的95中心区间。l 注1：该名词取代不正确的用词，如“正常范围”。l 注2：将参考区间定义为95中心区间是约定俗成的。某些特定情况下，对参考区间另外取值或不对称取值可能更为适当。参考范围定义 所有参考抽样组的各个参考值的集合。 注1：假定参考总体分布范围可通过参考抽样组参考范

27、围和使用适当统计方法进行检验。 注2：参考抽样组是能代表参考总体的足够数量的个体。生物参考区间定义参考个体和总体定义 参考个体：依临床对某检验项目的使用要求确定选择原则，以此选择检测参考值的个体。注：确定该个体的健康状态非常重要。 参考总体：所有参考个体的总和。注：参考总体中的参考个体数量通常未知，因此它是一个假设的实体。建立参考区间：CLSI文件 C28-A2，How to Define and Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory，2000C28-A2方案和要求 建立参考区间实验步骤：1.查阅文献，列出该项目生物变

28、异和分析干扰因素，供选择参考个体时用。2.建立选择、排除和分组标准，设计一个适当调查表，该调查表能在潜在参考个体中显示这些标准。3.为参考区间研究的参与者编制知情同意书，参考个体完成调查表。4.基于调查表和其它健康评价结果对潜在的参考个体分类。5.依排除标准或其它指示缺乏良好健康状况的评价，从参考样品组中排除不符合要求候选对象。6.设定可信限，确定合适参考个体数。7.采集前告诉受检者要求详细要求，做好采样前的各项准备工作。8.正确收集和处理标本，方式须与为患者进行的实际常规操作一致。9.在良好控制条件下，用事先指定方法对处理好样品进行检测，获得参考结果。10.检查参考数据，绘制直方图，了解数据

29、分布特性。11.检查有无离群值，若有按事先约定原则，剔除不符合要求数据，再补上必需数据。12.选择一种评估方法，估计参考区间。 参考抽样组最小数量：建议至少需要120个参考数据，若需分组，则每组也应有120个数据。 离群值处理：用1/3规则判断：将疑似离群值和其相邻点的差值（D）和数据全距（R）相除，求D/R比值。若比值1/3，为离群值，应删除。 参考分组：两组间均值差异有无统计学意义，作Z检验。三个或更多组别间均值差异有无统计学意义，推荐使用ANOVA统计。240名医学生按性别钙频数分布年轻男性、女性120例分组钙的均值和标准差验证：参考区间-Westgard 转移参考区间：相同分析系统参考区间转移；不同分析系统参考区间转移： 在同一实验室进行转移； 从一个实验室转移到另一个实验室。转移：参考区间 由方法比对计算：计算回归方程。对比方法： X下限和X上限。实验方法： Y下限=a+bX下限。 Y上限=a+bX上限。验证：参考区间 验证参考区间：系统性评审：审查原始参考区间有关因素，主观评价转移的可接受性。用20个参考抽样组数据进行验证。确定95%的标本检测结果在该方法参考区间内。若不符合，则增加至60个参考抽样组数据进行验证。验证：参考区间 验证参考区间：参考抽样组20例。要求：1个结果落在参考区间外。