临床微生物学检验

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1、1 临床微生物学的概念是什么？临床微生物学是研究微生物的形态、结构、分类、生命活动规律的一门科学，包括细菌学、病毒学、真菌学等。是临床医学的基础之一，指导感染性疾病的诊断、治疗和预防。2临床微生物学实验检查大概分几步骤？从患者标本分离培养微生物。对标本中分离到的微生物进行培养、鉴定。进行药物敏感性试验，解释和预报结果。阶段性分析药物敏感性实验，预测耐药趋势，监控和指导临床合理用药。3 什么是感染性疾病及影响因素？凡是由病原微生物引起的疾病统称为感染性疾病，而感染性疾病的发生主要与病原体的侵袭力及宿主的抵抗力密切相关。别外，临床上抗生素的大量滥用，引起了正常菌群失调和大量耐药菌株的出现，从而加重

2、了机体的内源性感染机率，这一定程度又加重了感染性疾病的发生。4 临床医师主要需要从临床微生物学实验室得到什么？能为临床提供医学决策的相关信息。指导临床正确收集标本的原则。安全及时的送检标本。微生物的正确鉴定和药物敏感性试验结果。能快速地报告实验结果，并做出相关的结果解释。能及时反馈医院内细菌感染分布、耐药状况和流行趋势等。 5 临床医师应如何避免感染性疾病的爆发流行？遵循病原学诊断，避免无指症用药。正确及时的采集标本，按要求及时送检微生物实验室检查。重视实验室的鉴定及药敏结果，结合临床患者病情合理使用抗生素。注意经验性治疗与靶向治疗相结合，依据病原学诊断及时调整治疗方案，改为针对性治疗。加强同

3、临床微生物实验室交流沟通，积极配合实验室做好院内感染监测、预防和控制工作。6 临床标本采集的一般原则是什么？在最适宜的时间收集标本，最好在使用抗生素之前或感染急性期采集。采集标本要有代表性和针对性，不同情况应区别对待，适宜地采取相应的方法收集标本，如尿液标本疑为厌氧菌感染时，应行耻骨上缘穿刺术取膀胱尿培养。采集标本必须来自实际感染的部位，严格无菌操作尽可能避免外源性污染。收集标本应当使用合适的收集器材、容器和培养基，以保证最大限度的发现微生物。标本采集、运送过程中要有专人负责，避免人为操作失误。采集标本不仅要防止被污染，同时也要注意安全，防止传播和自身感染。7采集过程中需要加抗凝剂的标本应注意

4、什么？对任何容易形成凝块的标本都应使用抗凝剂，因为如微生物被已凝固的物质包围，生长较困难。另外，像胸水、腹水等液体标本一旦凝固，很难接种培养，直接影响微生物的培养鉴定。目前，微生物学标本最常用的抗凝剂是多聚茴香脑磺酸钠SPS（Sodium polyanethol sulfonate），但其浓度不得超过0.025%(W/V)，否则会抑制一些奈瑟菌和厌氧性链球菌的生长。肝素也是常用抗凝剂之一，主要用于病毒培养，因为它能抑制革兰氏阳性菌和酵母菌的生长。柠檬酸盐和乙二胺四乙酸通常不用于微生物学标本。8 标本运送过程中应注意些什么？标本采集后，除了要及时送检外，另外在运送过程中要注意尽量保持标本的原有性

5、状。对于不能及时送检的要用专(圀运送，而对一些含有脆弱细菌的标本，需加入特别的保存剂。例如，尿液中加入硼酸能有效地抑制细菌生长，较好的保持尿液中菌落的数量；粪便中加入磷酸盐缓冲液有助于保持粪便中像志贺菌、沙门菌等的脆弱细菌。此外，甲醛溶液、绍丁溶液有助于保存寄生虫的滋养体和包囊，使其维持便于识别的形态。9 如何采集血液标本及注意事项？疑为菌血症或败血症时，一般情况下应在病人发热初期或发热高峰时采集，原则上应在抗菌治疗前尽早取血做细菌培养。若已用抗菌药物或疗效不佳时，在可能条件下停药24小时后再做血培养。连续做血培养3次，各次采血应在不同部位的血管穿刺，禁从静脉插管内髓炎时或长期使用抗菌药物患者

6、，抽取骨髓培养阳性率会远高于血液培养。对成人每瓶血培养应采血810ml，婴儿为12ml，儿童35 ml，骨髓为12 ml。如不能及时送检，应将已注血的培养瓶在室温存放，并不得超过12小时。 注意事项：不能用碘酒消毒瓶盖，只需70酒精消毒瓶盖。严格作好患者抽血部位的无菌操作。同时作厌氧和需氧培养时应先将标本接种到厌氧瓶中，然后再注入需氧瓶，严格防止将空气注入厌氧瓶中。如不能及时送检应于室温存放，切勿放冰箱存放。 10采集痰标本时应注意些什么？当疑为呼吸道感染性疾病时，应让患者取晨痰送检。取痰前用清水反复漱口后用力自气管咳出第一口痰于灭菌容器内，立即送检。对于痰量少或无痰的患者可采用支气管镜或气管

7、穿刺法取得。为了避免污染菌的干扰，最好连查3次。注意事项：采集标本以清晨为佳，为减少口腔正常菌群污染标本，采集前应充分漱口。取痰标本应是深部的痰液而不是唾液，否则会影响检查结果。作结核分枝杆菌检查，痰量要多或留取24小时痰液，婴儿肺结核要用胃管取痰。约有1412肺部感染患者可能发生菌血症，应同时作血培养。 对一些特殊患者可采用支气管镜采集法及气管穿刺法取痰。11如何采集尿液标本及注意事项？临床上有泌尿系统感染、肾结核、结石和无症状性菌尿等疾病指征时，通常应采集晨起第一次尿液（中段尿）送检。原则上应选择在抗菌治疗前采集，若已用药应停药一周后采集尿液送检。采集标本前，女性先以肥皂水清洗外阴部，再以

8、灭菌水或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗尿道口，然后排尿弃去前段尿，留取中段尿10ml左右于无菌容器内，立即加盖送检。男性先用肥皂水清洗尿道口，后用清水冲洗，就可采集中段尿。包皮过长者，为防止污染，可将包皮翻开冲洗，再取中段尿。疑为尿道炎时，可将最初34ml尿收集在灭菌容器中。如反复检查为同一细菌，也应考虑为病原菌。必要时可采用膀胱穿刺术取尿。注意事项：尿液标本的采集和培养中最大的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作。尿液标本采集后应尽快送检（12小时内），否则会影响细菌检查的正确性。多数药物均通过尿液排泄，因此，无论用何种方法采集尿液均宜在用药之前进行。尿液中不得含有防腐剂或消毒剂。疑为结核分

9、枝杆菌时，可用清洁容器，留24小时尿取其沉渣1015 ml送检。12穿刺液包括哪些？采集中应注意些什么？穿刺液主要包括脑脊液、胆汁、胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等。在正常人体中，上述体液均是无菌的，有感染的情况下检出的细菌，应视为病原菌，应给予及时正确的治疗。怀疑为脑膜炎的病人，用腰穿方法采集脑脊液2 ml左右，在常温下15分钟内送检。标本不可置冰箱内保存，否则会使病原菌死亡。胆汁及其它穿刺液采集到无菌针管或无菌试管内立即送检。注意事项：标本采集应在用药之前。严格无菌操作，避免污染。作脑脊液培养时，建议同时作血培养。为防止穿刺液的凝固，最好在无菌试管中先加入灭菌肝素。13创伤和化脓性标本

10、采集方法是什么？软组织的急性化脓性炎症、化脓性疾病、脓肿和创伤感染等疾病可求取标本送检。对开放性感染和已溃破的化脓灶，标本采集前先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用灭菌拭子采取脓液及病灶深部的分泌物。如为慢性感染，污染严重，很难分离到致病菌，可取感染部位下的组织，研磨成组织匀浆后送检。闭锁性脓肿可行手术引流或穿刺法取标本于灭菌容器或灭菌注射器内送检。注意事项：尽可能在用药前采集标本，采集前一定要作好清洗、消毒工作。不能立即送检的标本，应放4保存；培养淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的标本除外。深部脓肿常由包括厌氧菌在内的混合细菌感染所致, 若有条件应作厌氧菌培养，采集标本应遵守厌氧菌感染标本的采集原则

11、。14粪便标本培养应如何采集？腹泻为大便送检的重要指征，婴幼儿和小儿可见高热惊厥。当疑为细菌性痢疾、肠炎、肠结核和顽固性腹泻时，应在急性期采集，亦最好在用药之前，以提高检出率。肠热症患者应在两周以后采集。采用自然排便法或直肠拭子法，挑取有脓血，粘液部位的粪便23置于无菌容器中送检。注意事项：为提高检出率，要采集新鲜粪便作培养。腹泻病人应尽量在急性期采集标本（3天以内），以提高阳性率。虽粪便含有多种杂菌，但应尽量采用无菌容器。15生殖道标本的采集原则和注意事项是什么？ 当疑为生殖道感染性疾病时，首先排除是否有不洁性交史，然后根据症状确定检查方向。对于男性患者来讲，先检查尿道是否有脓性分泌是前列腺

12、液、精液。采集标本时应清洗尿道口，再用无菌拭子擦取尿道口脓性分泌物或深入尿道内2-4厘米取分泌物，检查精液患者应禁欲5天以上，采用体外排精法射精于灭菌容器送检。对于女性患者，先用窥器扩张阴道，然后用灭菌棉拭子取阴道后穹隆处或宫颈分泌物作培养或涂片镜检。注意事项：生殖器是开放性器官，标本采集过程中应遵循无菌操作以减少杂菌污染。阴道内有大量正常菌群存在，采取宫颈标本应避免触及阴道壁。疑产妇有宫腔感染，待胎儿娩出后取宫腔分泌物，并同时取一同送检。沙眼衣原体在宿主细胞内繁殖，采集时尽可能多的取上皮细胞。16哪些标本不能作厌氧菌培养及如何运送标本？痰、支气管镜采样(无特殊保护套)、咽拭子、排道拭子不能做

13、厌氧菌培养，粪便标本厌氧菌培养，只能做难辨梭菌的培养。在运送中最常用的是注射器运送法，此外还有无氧小瓶运送法、棉拭运送法、组织块运送法、大量标本运送法。标本采集后应尽快送到实验室，最迟不超过半小时。标本不应放在冰箱里，因为低温对一些厌氧菌有害。17细菌的超微形态及革兰氏阳性和阴性菌的区别如何？细菌是一类原核细胞型微生物，体积微小，基本形态有球形、杆形和螺形三种。之所以称原核是指其核则不是一个具体的结构，没有核膜。细菌的基本结构包括细胞壁、细胞膜、细胞浆、核质和胞浆颗粒等。除动物细胞无细胞壁外，各类生物的细瘀细胞壁。例如，植物的细胞壁由纤维素构成，霉菌的细胞壁则为几丁质，细菌细胞壁的成分为肽聚糖

14、、垣酸和脂多糖。革兰氏阳性菌细胞壁厚，肽聚糖骨架通过四肽侧链和五肽桥连接成为三维空间。不含有芳香氨基酸和含硫氨基酸。革兰氏阴性细菌的细胞壁薄，除少量肽聚糖构成细胞壁的内层外，由大量脂多糖构成其外层，并有脂蛋白形成镶嵌结构，其中含有芳香氨基酸和含硫基酸。18细菌的特殊结构都有哪些？其功能是什么？细菌主要有鞭毛、菌毛、荚膜和芽胞。鞭毛是细菌的运动器官，由简单的角蛋白肌蛋白组成。菌毛分为普通菌毛及性菌毛两种，普通菌毛能与宿主细胞表面的菌毛受体相结，发挥粘附作用，而性菌毛中空呈管状，能在细菌之间通过接合传递遗传物质，故性菌毛与细菌的遗传变异有关。荚膜是细胞壁外的一层多糖物质具有抗原性，能抵抗机体吞噬细

15、胞的吞噬作用。芽胞是某些细菌的繁殖体，在一定环境条件下，由于胞浆脱水浓缩而成一个圆形或卵圆形小体，具有多层膜结构，对外界理化因素抵抗力强，可潜伏数年或几十后重新繁殖生长。19什么是L型细菌？其形成原因？L型细菌是一类细胞壁缺陷的细菌，形态各异大小不一，染色时不易着色，且着色不均匀，革兰兰阴性菌均可形成，又称为“原生质体和原生质球”，凡能破坏肽聚糖结构都可诱导细菌形成L型，其表现为具有明显的多形性，革兰染色阴性，能通过细菌滤器，对渗透压敏感。L型细菌的主要意义在于仍有致病性，能引起间质性炎症。而且是临床上感染漏诊的主要原因之一。20脂多糖由哪几部分组成？其功能是什么？脂多糖是由类脂和多糖组成，是

16、革兰阴性菌的内毒素，包括类脂A、核心多糖和特异多糖等三部分。类脂A是内毒素的毒性分子，与细菌的致病性有关，无种属特异性，故不同的革兰阴性菌感染时，其毒性大致相同。核心多糖具有细菌属和组的特异性，同一属和组的细菌，其核心多糖均相同。特异性多糖是脂多糖的最外层，构成重要的菌体表面抗原，从而决定了种或型的特异性。21如何才能更好的发现和鉴定微生物？首先，选择适合特定标本类型的初次培养基，为了发现所有潜在的重要致病菌，还应选择适当的孵育温度和气体。其次，对初次培养基上所发现的分离物应确定它们进一步鉴定的内容。最后，在已鉴定的细菌中确定哪种要进行抗微生物敏感性试验。22正常菌群的含义是什么？人自出生后，

17、外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种通道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，存在着对人体无害的微生物群，包括细菌、真菌、螺旋体、支原体等。它们在与宿主的长期进化过程中，微生物群的内部及其与宿主之间互相依存、互相制约，形成一个能进行物质、能量及基因交流的动态平衡的生态系统习惯称之为正常菌群（Normal flora）。正常菌群大部分是长期居留于人体的又称为常居菌，也有少数微生物是暂时寄居的，称为过路菌。23正常菌群的生理作用是什么？生物拮抗作用：正常菌群通过粘附和繁殖能形成一层自然菌膜,是一种非特异性的保护膜,可促机体抵抗致病微生物的侵袭及定植,从而对宿主起到一定

18、程度的保护作用。正常菌群除与病原菌争夺营养物质和空间位置外，还可以通过其代谢产物以及产生抗生素、细菌素等起作用。可以说正常菌群是人体防止外袭菌侵入的生物屏障。刺激免疫应答：正常菌群释放的内毒素等物质可刺激机体免疫系统保持活跃状态，是非特异免疫功能的一个不可缺少的组成部分。合成维生素：有些微生物能合成维生素，如核黄素、生物素、叶酸、吡哆醇及维生素K等，供人体吸收利用。降解食物残渣：肠道中正常菌群可互相配合，降解末被人体消化食物残渣，便于机体进一步吸收。24什么是条件致病菌和菌群失调？在一定条件下，正常菌群中的细菌也能使人患病：由于机体的防卫功能减弱,引起自身感染。例如皮肤粘膜受伤（特别是大面积烧

19、伤）、身体受凉、过度疲劳、长期消耗性疾病等，可导致正常菌群；由于正常菌群寄居部位的改变，发生了定位转移，也可引起疾病。例如大肠杆菌进入腹腔或泌尿道，可引起腹膜炎、泌尿道感染。因此，这些细菌称为条件致病菌。在正常情况下，人体和正常菌群之间以及正常菌群中各细菌之间，保持一定的生态平衡。如果生态平衡失调，以至机体某一部位的正常菌群中各细菌的比例关系发生数量和质量上的变化，称为菌群失调。25引起菌群失调的原因有哪些？ 菌群失调的常见诱因主要是抗生素、同位素、激素的不合理使用，另外患有慢性消耗性疾病时肠道、呼吸道、泌尿生殖道的功能失常也是重要原因。去除诱因后一般可使菌群复常，也有长期失调难于逆转的情况。

20、26临床上常见菌群失调症有哪些？临床上常见的菌群失调症有：耐药性葡萄球菌繁殖成优势菌而发生腹泻，偶尔发生致死性葡萄球菌脓毒血症；变形杆菌和假单胞菌生长旺盛并侵入组织发生肾炎或膀胱炎；白色念珠菌大量繁殖，引起肠道、肛门或阴道感染，也可发展成全身感染；艰难梭菌在结肠内大量繁殖，并产生一种肠毒素及细菌毒素，导致假膜性肠炎。27常用培养基有哪几种？其成分主要是什么？常用培养基有普通培养基、营养培养基、选择培养基和增菌培养基。培养基的主要成分有氮源、碳源、无机盐、水分及一些生长因子，它们主要为细菌的生长繁殖提供营养和生长环境。28通常培养基中根据需要可加入哪些抑制剂和指示剂？依据细菌生长代谢特性，可选择

21、性的加入某些抑制剂和指示剂。常用抑制剂有胆盐、煌绿、玫瑰红酸、亚硫酸钠、亚硒酸钠、某些染料以及多种抗生素物质。常用指示剂有酚红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、溴酚红、中性红、中国蓝、甲基红、酸性复红等。29标本接种技术有几种？平板接种法：初次接种成功后，连继划线或分四区划线接种。液体接种法：将试管倾斜30度角，接种环触到试管的内壁研磨数次，然后让试管回复到原来的直立位置淹没接种部位，这样可以避免气泡的产生。 琼脂斜面接种法：首先将接种针插入斜面正中，垂直刺入底部，抽出接种针令其在斜面琼脂上作S形划线。穿刺接种法：本法多用于双糖、半固体或明胶等高层培养基的接种，由培养基中央刺到距管底约半厘米处，然后沿

22、穿刺线退出接种针。倾注培养法：该法常用液体标本的细菌定量计数。方法是用无菌吸管吸取原标本或经适当稀释的标本各1 ml ，分别置于直径为9cm 的无菌平皿内，倾入已融化并冷至50 左右的培养基约15 ml ，立即混匀待凝固后倒置于351 培养18 24 小时，做菌落计数。30.细菌产生耐药性的机制有哪些?细菌产生可破抗生素或使之失去抗菌作用的酶。如-内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、拓扑异构酶等。对抗菌药物的渗透性降性。主要表现：外膜通透性降低及药物泵出系统。抗生素作用靶位的改变。如细菌的青霉素结合蛋白改变，导致对-内酰胺类抗生素的耐药。代谢途径的改变。如在肠球菌培养基中加入亚叶酸，肠球菌利用亚叶酸后

23、可对磺胺-甲氧嘧啶由敏感转为耐药。31-内酰胺酶的分类及作用机制是什么？-内酰胺酶是一群酶，根据分子学结构可将其分为四群。A群-内酰胺酶为丝氨酸蛋白酶，主要作用于青霉素类药物，编码基因位于染色体或质粒上，可从一个细菌转移至另一个细菌。B群-内酰胺酶为金属酶，其活性部位为结合锌离子的硫醇基。C群-内酰胺酶主要是头孢菌素酶，存在于革兰氏阴性菌染色体上，可被诱导或重组。D群-内酰胺酶为苯唑西林酶。大量试验证实，-内酰胺类抗生素和细胞壁前体的存在都可以诱导-内酰胺酶的合成，其作用机制为-内酰胺酶与催化细菌细胞壁肽聚糖合成的青霉素结合蛋白空间结构相似，可竞争性水解药物-内酰胺环使酰胺键断裂而失去抗菌活性

24、，其水解效率是细菌耐药性的主要决定因子。32临床上重要的-内酰胺酶主要有哪几种？ 超广谱-内酰胺酶，主要由克雷伯菌属和大肠埃希菌产生，对第三代头孢和氨曲南耐药，而对碳青霉烯类和头霉烯类敏感。对-内酰胺抑制剂敏感性下降的-内酰胺酶，主要原因之一是菌株-内酰胺酶的过度表刀就是产生诱导耐酶抑制剂的-内酰胺酶，常表现对酶抑制剂复合药的敏感性下降，而对第一代头孢菌素敏感。质粒介导的AMPC酶，常见于克雷伯菌、弗劳地枸椽酸杆菌、阴沟杆菌、奇异变形和蜂房哈夫尼菌等，表现对一代至三代头孢菌素、头霉素类、氨基糖苷类耐药，但对碳青霉烯类、四代头孢菌素和喹诺酮类敏感。水解碳青霉烯类的-内酰胺酶，常见铜绿、鲍曼等非发

25、酵菌属，表现以碳青霉烯类和单环-内酰胺类抗生素为代表的多重耐药。33耐酶抑制的广谱-内酰胺酶的产生机制是什么？如何筛选鉴别？ 大量含酶抑制复合药的使用，可诱导原本对酶抑制剂敏感的酶大量产生，使细菌对酶抑制剂降；另一机制产生了源于TEM-1、TEM-2、SHV-1和OXY-2的耐酶抑制剂的-内酰胺酶(IRT)，大肠埃希菌最易产生IRT。区分是TEM-1、TEM-2或SHV-1的大量表达还是IRT，可用头孢菌素敏感试验鉴别，纸片法表型为阿莫西林和替卡西林耐药，对阿莫西林/克匀西林/克拉维酸中介或耐药，而对头孢菌素敏感。34常用-内酰胺酶抑制剂有哪些？又有何区别？-内酰胺酶抑制剂与-内酰胺酶有较高的

26、亲和性，以竞争性和不可逆的抑制方式发挥作用，与-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性。常用-内酰胺酶抑制剂有克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦。克拉维酸可由链霉菌培养液中分离得到，除了对-内酰胺酶有抑制剂作用外，同时也可作用青霉素结合蛋白靶位，与-内酰胺类抗生素共同影响细巴坦是半合成的酶抑制剂，其抑酶作用和克拉维酸相似，但穿透革兰阴性菌外膜能力差，可抑制由质粒或染色体介导的-内酰胺酶(型染色体介导酶除外)。他唑巴坦也是半合成酶抑制剂，其抑酶作用范围广，抑制作用优于克拉维酸和舒巴坦。35-内酰胺类抗生素的作用机制是什么？青霉素类乃至整个-内酰胺类抗生素的作用机制是阻断肽聚糖合成的最后阶段即肽聚糖链的组

27、装和三维结构的构建。该阶段反应通常由几种酶催化完成，如转糖基酶(催化N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间形成-1,4糖苷键)、转肽酶(催化四肽侧链与五肽桥形成D-丙氨酰D-丙氨酸肽链)、羧肽酶、内肽酶等。不同的-内酰胺类抗生素在不同程度上抑制上述酶的作用，从而抑制细菌细胞壁的完整性，使菌体形成丝状体或球形体，最终溶解死亡。36.氨基糖苷类抗生素的作用机制是什么？氨基糖苷类由链霉菌属和小单胞菌属发酵滤液中提取，能与细菌核糖体30S亚基发生不可逆的结合，抑制MRNA的转录和蛋白质合成，导致细菌死亡，同时该类抗生素还能依靠其离子的吸附作用，吸附在菌体的表面，造成细胞膜的损伤，导致膜的渗漏使胞内的K+

28、、嘌呤等重要生命物质外漏，为杀菌类抗生素。与细胞壁合成抑制药物联合使用时可产生协同作用，破坏细胞壁完整性，使药物易于进入菌体而达到核糖体作用靶位。37.喹诺酮抗生素的作用机制？喹诺酮类抗生素作用于DNA旋转酶，DNA旋转酶在原核细胞DNA复制过程中引入负超螺旋结构，使复制叉移动时不因张力太大而不能前进。由于药物拮抗了该酶干扰了细菌DNA复制、修复和重组，药物还能通过革兰阴性菌的外膜微孔和借助磷脂渗透作用进入细菌细胞，对繁殖期的细菌均有杀菌作用。38糖肽类抗生素的作用机制？肽类抗生素是由氨基酸通过肽键连接而成化合物，结构上具有较大异源性，抗菌谱窄，但抗菌作用强，具有肾毒性不良反应。作用机制是与肽

29、聚糖合成中间产物D-丙氨酰-D丙氨酸末端形成复合物，可阻断肽聚糖合成过程中转糖基酶、转肽酶及羧肽酶的作用，从而阻止了细胞壁的合成。39大环内酯类抗生素作用机制是什么？该类抗生素的分子结构中具有14-16原子的大脂肪内酯环，可逆的结合在细菌核糖体50S大亚基的23S单位上抑制肽酰基转移酶，影响核蛋白位移，抑制细菌蛋白合成和肽链的延伸。现常用有克拉霉素、阿齐霉素等抗菌活性强、抗菌谱广的药物。40抗菌药物敏感性试验(AST)意义方法有哪些?AST的意义：可预测抗菌治疗效果，即AST试验结果为敏感时，治疗可能有效；试验结果为耐药时，治疗一定失败；而中介意味着高于常规治疗剂量或药物浓度集中的生理部位可能

30、有效。指导临床医生合理选择抗生素，可依据实验结果调整经验性氀疗。AST的方法：测量药物最小抑菌浓度的琼脂稀释法和肉汤稀释法。测量含药纸片周围直径大小的K-B纸片琼脂扩散法。结合扩散法和稀释法原理特点的E试验。最低杀菌浓度的测定。联合药物敏感性试验，可为临床选用最有效的抗菌药物组合提供实验依据。41耐药性的产生机理是什么？抗微生物药物对微生物群体有很强的选择压力，使天然能耐受它们的微生物或经诱导变异产生抗药抗性的微生物存活下来。微生物的变异是其进化基础，变异有多种机制，小的变异包括碱基对的点突变，可以改变抗微生物药物的作用靶点和干扰它们的活性。大的变异是一大段DNA作为一个整体重新排列，这种变化

31、常由在染色体中可以独立移动的特殊基因单位，即转座子或插入序列产生。细菌基因的变异还可通过质粒，噬菌体或可转移的基因单位获取外源性DNA而产生。耐药性可通水平或垂直传插在不同种或同种间扩散。这种现象发生的例子如葡萄球菌盒式染色体SCCmec在获得性耐药中发挥了很重要的作用。其中SCCme戀生素耐药岛：它包含对甲氧西林产生耐药的mecA基因，有的SCCmec还包含对非-内酰胺抗生素和重金属产生耐药的质粒和转座子。还有四环素抗性转座子在淋球菌、人支原体之间的传播。这些机制使细菌具有能产生抗任何微生物药物抗性的能力。42.常用的生化鉴定培养基有哪些？（一） 糖发酵培养基（1）成分蛋白胨水或肉膏液（p

32、H7.4）100 ml所需糖、醇或糖苷类物质0.5 1.0g16gL 溴甲粉紫乙醇溶液0.1 ml（2）制法 将上述各物质加热溶解后，分装试管。 高压（55.161kPa） 灭菌15 分钟，备用。 如需观察产气反应，应于分装前在试管中加一倒置的小玻管。 亦可制成半固体发酵管，即于上述成分中加入4 6gL 的琼脂，加热溶化后分试管。（3）用途 观察细菌对糖、醇或苷发酵能力，用于鉴定细菌。（二） 氧化发酵（O F） 培养基（1）成分蛋白胨 2g氯化钠 5gK2HPO4 0.3g葡萄糖 10g2gL 溴麝香草酚蓝溶液12 ml水1000 ml（2）制法 将蛋白胨、盐类加水溶解后，校正pH 至7.2

33、。 加入葡萄糖、琼脂，加热溶解后，加入指示剂，分装试管。 高压（68.95kPa） 灭菌15 分钟，使成高层琼脂，备用。（3）用途 测定细菌分解葡萄糖的代谢类型用。（三） 克氏铁琼脂（1）成分蛋白胨或多胨20g牛肉膏 3g酵母浸膏 3g乳糖 10g葡萄糖 1g氯化钠 5g拘橼酸铁铵 0.5g硫代硫酸钠 0.5g琼脂 14g酚红 0.025g水1000 ml（2）制法 将上述各成分（酚红除外） 混合，加热溶解，校正p H 至7.4 ，加入酚红。 分装试管，每管约3 ml 。 高压（68.95kPa） 灭菌15 分钟，趁热取出，立即置成深底层斜面（斜面及底层约各占一半），凝固后备用。（3）用途 鉴

34、别肠杆菌科细菌（四） 三糖铁琼脂（1）成分多胨或胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 5g乳糖 10g蔗糖 10g葡萄糖 1g硫代硫酸钠 0.3g硫酸亚铁 0.2g琼脂 15g水1000 ml4gL 酚红溶液6 ml（2）制法 除酚红外，将上述各成分混合。加热溶解，校正p H 至7.4 ，加入酚红。 分装试管，每管3 4 ml ，高压（68.95kPa） 灭菌15 分钟。 趁热取出，置成底层较深的斜面，凝固后备用。（3）用途 鉴别肠杆菌科细菌。（五） 胰蛋白胨水（1）成分胰胨或其他含色氨酸丰富的胨 1g氯化钠 0氀100 ml（2）制法 将胰胨、氯化钠加入水后，加热溶解，校正pH 至7.2 7.4 ，

35、分装试管。 高压（68.95kPa） 灭菌15 分钟即成。（3）用途 细菌靛基质试验用。（六） 葡萄糖蛋白胨水（1）成分蛋白胨 0.5g葡萄糖 0.5g磷酸氢二钾 0.5g水100 ml（2）制法 将上述成分混合于水中，加热溶解后校正pH 至6.8 7.2 ，分装试管。 高压（68.95kPa） 灭菌15 分钟即成。（3）用途 细菌甲基红，V P 试验用。（七） 构橼酸盐培养基（1）成分枸橼酸钠（含2 H2O） 0.2g硫酸镁（含7 H2O） 0.02g磷酸二氢铵 0.1g磷酸氢二钾 0.1g氯化钠 0.5g琼脂 2g水100 ml2gL 溴麝香草酚蓝乙醇溶液4 ml（2）制法 将上述各成分（

36、溴麝香草酚蓝除外） 渀解， 校正p H 至6.8 ，再加入指示剂混匀，分装试管。 高压（103.43kPa） 灭菌15 分钟后，趁热取出置成斜面，备用。（3）用途 细菌构橼酸盐及无机铵利用试验用。（八） 氨基酸脱羧酶培养基（1）成分氨基酸 1.0g蛋白胨 0.5g酵母浸膏 0.3g葡萄糖 0.1g吡多醛盐酸盐 0.5 mg水100 ml16gL 溴甲酚紫乙醇溶l（2）制法 将上述各成分（溴甲酚紫除外） 混合加热溶解后，校正pH 至6.8 ， 加入指示剂，混匀。 分装小试管，每管约0.5 1.0 ml ，于每管内加入液体石蜡一层（约5 m m）。 高压（103.43kPa） 灭菌15 分钟后，备

37、用。（3）用途 鉴别肠杆菌科及弧菌科细菌用。（九） 尿素培养基（1）成分蛋白胨 1g氯化钠 5g磷酸二氢钾 2g葡萄糖 0.1g尿素 2g水1000 ml4gL 酚红溶液3 ml（2）制法 将上述各成分（酚红除外） 混合，加热溶解，校正pH 至68 ， 再加入酚红混匀，分装试管。 高压（6895kPa） 灭菌15 分钟，备用。（3）用途鉴定细菌能酶。（十）Thornley 精氨酸培养基（1）成分L 精氨酸1.0g蛋白胨 0.1g氯化钠 0.5gK2HPO4 0.03g琼脂0.00 ml酚红0.001g（2）制法 将上述成分（酚红除外） 混合加热溶解后，校正pH 至7.0 7.2 ，加入酚红混匀

38、，分装小试管。 高压（103.43kPa） 灭菌15 分钟后，备用。 同时配制不含精氨酸的培养基作为对照。（3）用途 用于检测细菌能否产生精氨酸双水解酶，主要用于肠杆菌科，假单胞菌属及非发酵菌的鉴定。（十一） 甘油品红培养基（1）成分牛肉膏10g蛋白胨20g水1000 ml甘油1 ml100gL 碱性品红乙醇溶液0.2 ml100gL 无水亚硫酸钠水溶液（新鲜配制） 1.66 ml（2）制法 将牛肉膏、蛋白胨、水加热溶解后，校正pH 至8.0 ，加入甘油混匀。 高压（103.43kPa） 灭菌15 分钟后，备用。 临用时，加入碱性品红及亚硫酸钠液，分装试管。（3）用途 鉴定沙门菌属细菌用。（十

39、二） 马尿酸钠培养基（1）成分马尿酸钠1g肉浸液（pH7.4）100 ml（2）制法 将马尿酸钠溶于肉浸液内，分装于小试管内。 高压（103.43kPa） 灭菌15 分钟后备用。（3）用途 鉴定B 群链球菌用。43.常用的生化鉴定试验有哪些?一 、碳水化合物的代谢试验（一） 糖类发酵试验（1）原理各种细菌含有不同的分解糖（醇、苷） 类的酶，分解糖类的能力各有不同，且不同细菌分解同一种糖的代谢产物也不一定相同。细菌分解糖类后形成的代谢产物随细菌种类而异，有的产酸，有的产酸产气。可根据糖分解的特性鉴别细菌。（2）种类种类很多。常用的单糖类有：阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等。

40、双糖类有乳糖、麦芽糖、蕈糖等。多、淀粉、糊精。醇类包括甘露醇、甘油、侧金盏花醇、卫矛醇、山梨醇、肌醇等。（3）方法 细菌经分离纯化后， 根据待检菌的分解特性选择合适的含糖培养基，将纯种细菌接种该培养基中， 置温箱内培养数18-24小时，取出观察结果。（4）结果能分解糖产酸的细菌，培养基中指示剂是否呈现酸性反应。不能分解该糖则无颜色变化。产气可使半固体培养基内或液体培养基中的倒置小管内出现气泡，固体培养基则出现裂痕。（5）应用糖分解试验是细菌生化试验中最常用的生化反应。可依据细菌分解糖的能力各异而区分和识别不同的细菌。如沙门菌能发酵葡萄糖，但不发酵乳糖，大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖。脑膜炎球菌能分

41、解葡萄糖和麦芽糖，而淋球菌只能分解葡萄糖，不分解麦芽糖。（二） 氧化发酵试验（OF 试验）（1）原理细菌在分解糖的过程中，根据有无分子氧参加，分为氧化型和发酵型。能在无氧环境中不能分解葡萄糖，称为氧化型。可进行无氧降解的，称发酵型。发酵型细菌在有氧和无氧的环境中都能分解葡萄糖。兼性厌氧菌为发酵型细菌。不分解葡萄糖的细菌称产碱型。（2）方法取2支HL(Hugh-Leifson)培养管,用接种针挑取少许纯培养细菌，穿刺接种至两支培养基的管底，将其中1 支在接种后加无菌液体石蜡或者凡士林在培养基表面，高度约1cm 。然后将两支培养管置35 孵育48 小时后观察结果。（3）结果培养基由绿色变黄表示细菌

42、分解葡萄糖产酸，颜色不变表示不分解葡萄糖。两管培养基均变黄色为发酵型，若加液体石蜡的一管颜色不变而另一管变黄色为氧化型，两管均不变色为产碱型。（4）应用O F 试验可区分细菌的代谢类型， 有助于鉴别区分细菌。如肠杆菌科细菌都是发酵型细菌，绝大多数的非发酵菌为氧化型或产碱型细菌。葡萄球菌为发酵型而微球菌为氧化型。（三） 七叶苷水解试验（1）原理七叶苷经细菌水解生成七叶素，七叶素能与培养基中构橼酸铁的二价铁离子结合生成爀，使培养2）方法 将细菌接种于七叶苷培养基上，在35 孵育过夜。（3）结果 细菌生长并使培养基变黑为阳性。（4）应用 主要用于区分肠球菌、D群链球菌和其他链球菌，前两者阳性。也可用

43、于革兰氏阴性杆菌和厌氧菌的鉴别试验。（四） 淀粉水解试验（1）原理细菌产生淀粉酶可将培养基周围琼脂中的淀粉水解。加碘液后，菌落周围形成无色透明区。而琼脂中没分解的淀粉与碘作用产生蓝色。试剂可用卢戈碘液或革兰染液中的碘液。（2）方法将细菌划线接种或点种在淀粉血清琼脂平板或水解酪蛋白琼脂（M H 琼脂）平板，经35 培养过夜，在菌落上滴加碘液。（3）结果菌落周围出现透明区，而其他部位培养基呈蓝色为阳性。（4）应用某些细菌如白喉杆菌具有淀粉酶，本试验呈阳性，可用此试验鉴别细菌。（五）半乳糖苷酶试验（1）原理某些细菌具有半乳糖苷酶，该酶可分解邻 硝基苯D 半乳糖苷(ONPG)，生成黄色的邻硝基酚。（2

44、）方法圀三糖铁培养基上刮取一环新鲜菌龄的菌苔，加于无菌盐水0.25 ml 中制成浓菌悬液，加入甲苯1滴，充分振摇， 将试管置于37 水浴中5分钟， 加入ONPG 溶液0.25 ml ，在37 水浴中保温，于20分钟、4小时、18小时和24小时观察结果。（3）结果出现黄色为阳性反应，不变色为阴性反应。通常在20 30 分钟内显色。（4）应用此试验是测定不发酵或迟发酵乳糖的细菌是否产生半乳糖苷酶。由于细菌分解乳糖要有两种酶，一是半乳糖昔渗透酶，另一是半乳糖苷酶。当缺乏渗透酶时，乳糖不能进入细胞，乳糖分解就不能进行。这两种酶都是在乳糖存在的条件下诱导细菌产生。迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG 为阳性

45、，如埃希菌属、枸橼酸杆菌属。不发酵乳糖的细菌为阴性，如沙门菌属、变形杆菌属。可用本试验作为迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定方法。（六） 甲基红试验（1）原理细菌在糖代谢过程中,能分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步将丙酮酸代谢为乳酸、乙酸、甲酸等,使培养基的p H 值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂即显红色。某些细菌虽能分解葡萄糖，但产酸量少，培养基酸碱度在pH 值5.4 以上，加入甲基红指示剂呈黄色。甲基红变色范围为pH 值4.0 6.0。（2）方法将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置35 培养24天。2天后取出部分菌液滴加2滴试剂，若为阴性结果，继续培养至4天再试。（3）结果红色为阳性，橘红色为弱

46、阳性,黄色为阴性。（4）应用可鉴别肠杆菌科内各菌属。沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、埃希菌属为阳性，肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性。较常用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的区别，前者阳性，后者阴性。（七） VP 试验（4）原理某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，并进一步脱羧成为乙酰甲基甲醇。后者在碱性环境中被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰可与培养基中精氨酸的胍基起作用，生成红色化合物。若培养基内，可加入少量肌酸、肌酐等含胍基的化合物，可加速此反应。（2）培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基。（3）试剂 a.奥梅拉试剂：氢氧化钾40g 溶于水10 ml ，加肌酸03g 。b.贝立脱试剂：甲液：6 萘酚乙醇

47、溶液。乙液：40 氢氧化钾。（4）方法a. 奥梅拉法：将细菌接种在上述培养基内，置35 培养48小时。在培养液2 ml中加入奥梅拉试剂0.2 ml ，置50水浴中2小时或37 4小时，充分振摇，观察结果。b. 贝立脱法：接种及温育同上。在培养液2 ml 中加入贝立脱试剂甲液1 ml 及乙液0.4 ml ，混合后置37中30分钟观察结果。如为阴性应继续置374小时再观察。（5）结果 呈红色为阳性。（6）应用常与甲基红试验一起使用。可区别肠杆菌科细菌。本试验阳性， 甲基红试验阴性，反之亦然。大肠埃希菌VP阴性而产气肠杆菌阳性。注：试剂甲液在室温阴暗处可保存1 个月，乙液可长期保存。（八） 甘油复红

48、试验（1）原理细菌分解甘油产生丙酮酸，丙酮酸脱羧而为乙醛，乙醛与无色的复红生成醌式化合物，显紫红色。（2）方法将细菌接种于甘油复红肉汤培养基，在35 培养8天， 每天观察结果。将未接种的培养基在35培养，作为对照。（3）结果紫色为阳性（），紫红色为阳性（），与对照管颜色相同为阴性。（4）应用 主要用于沙门菌属菌种间的鉴别。二 、蛋白质和氨基酸的代谢试验（一） 吲哚（靛基质） 试验（1）原理有些具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可与对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。（2）试剂柯凡克（Kovac）试剂：对二甲基氨基苯甲醛5g ，戊醇75 ml ，浓盐酸50 ml 。将

49、对二甲基氨基苯甲醛加入乙醇内， 振摇使溶， 徐徐加入浓盐酸， 边加边摇即成。欧氏（Ehrlich） 试剂：对二甲基氨基苯甲醛4g ，95 乙醇380 ml ，浓盐酸80 ml 。配法与柯凡克试剂相同。（3）方法将细菌接种于蛋白陈水培养基中，置35培养1 2 天，沿管壁徐徐加入柯凡克试剂或欧氏试剂0.5 ml ，试剂浮于培养基之上，使成两层，即刻观察结果。（4）结果两液面交界处呈现红色为阳性，无红色为阴性。（5）应用主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。注：有些细菌产生吲哚量少，需用乙醚或二甲苯提取后才能与试剂起反应。如黄杆菌。（二） 硫化氢试验（1）原理某些细菌分解培养基中含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸

50、） 生成硫化氢，硫化氢遇铅或铁离子形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。（2）方法将细菌接种于醋酸铅培养基或克氏铁、三糖铁琼脂培养基中，置35培养2448小时，但惟赫夫尼亚菌需培养7天。每天观察颜色变化。（3）结果醋酸铅培养基变黑色为阳性，不变色为阴性。KI 或TSI 琼脂在底层和斜面交界处出现黑色沉淀为阳性。（3）应用主要用于肠杆菌鉴别。沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属硫化氢伀沙门菌属中也有部分菌为阴性。此外，腐败谢尔瓦菌是非发酵菌中唯一能产生硫化氢的细菌。（三） 尿素酶试验（1）原理某些菌能产生尿素酶，此酶能分解尿素形成氨，使培养基变碱，酚红指示剂随之变红色。（2）方

51、法将细菌接种于尿素培养基，置35过夜培养观察结果，阴性反应者应观察4 天。（3）应用主要用于肠杆菌科的鉴定。其中变形杆菌、克雷伯菌、摩氏摩根菌、和结肠耶尔昀罗菲登斯菌为阳性。（四） 明胶液化试验（1）原理细菌分泌的胞外蛋白水解酶，能分解明胶为氨基酸，使之失去原有的凝固力而液化。（2）方法将细菌接种于明胶培养基，在20 培养7天，每天观察结果。若室温较高， 培养基自行融化时，可在0 分钟后取出观察结果。明胶平板法：在营养琼脂中加入1 明胶倾注平板，可分成4 个区，每区划线接种1种细菌，经1 2 天培养，在培养基表面加氯化汞溶液（氢化汞12g ， 水80ml ，浓盐酸16ml），在菌落周围出现透明

52、带，表示细菌液化明胶。（3）结果明胶培养基半固体变成液体为阳性。明胶平板法菌落周围出现透明带为阳性。（4）应用根据细菌能否液化明胶，可有助于细菌的种、属的鉴定。如阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、沙雷菌、铜绿假单胞菌等为阳性。（五） 苯丙氨酸脱氨酶试验（1）原理细菌氀酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，与氯化铁作用形成绿色化合物。（2）方法将待检细菌大量接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面,在35培养过夜。滴加10 三氯化铁4 5滴，由斜面培养物上方流下。立即观察结果,延长反应时间会引起退色。（3）结果 斜面显示绿色为阳性。（4）应用本试验特异性较高。变形杆菌属、摩根菌属及普罗菲登斯菌为强阳性，其他肠杆

53、菌科细菌大多为阴性。可用于肠杆菌科细菌的鉴定。（六） 氨基酸脱羧酶试验（1）原理细菌如具有某种氨基酸脱羧酶，能使氨基酸脱羧、产生胺和CO2，使培养基变碱，指示剂变色。（2）培养基最常用的有3 种：赖氨酸脱羧酶培养基、鸟氨酸脱羧酶培养基、精氨酸脱羧酶培养基及对照培养基。（3）方法将细菌接种在上述含氨基酸的培养基及不含氨基酸的对照培养基中，接种后用无菌石蜡油覆盖，高度至少5m m 。在35培养4日观察结果。（4）结果开始阶段培养基由于葡萄糖分解呈酸性而呈黄色，以后变为紫色为阳性结果，若仅发酵莆萄糖显黄色为阴性。对照管应为黄色。（5）应用本实验可以作为肠杆菌科细菌鉴定的重要方法，对链球菌和弧菌科细菌

54、鉴定也有重要作用。（七） 精氨酸双水解试验（1）原理某些细菌可降解精氨酸为瓜氨酸和胺，瓜氨酸可降解为鸟氨酸、氨和二氧鄀又可受脱羧酶的作用，生成腐胺和二氧化碳。氨和腐胺可使培养基变碱，酚红指示剂随之变红色。（2）方法将细菌穿刺接种在索恩利（Thornley）培养基，并封以灭菌石蜡油，在35培养1 4 天， 每天观察培养基颜色变化。（3）结果培养基转为红色为阳性。三、碳源和氮源利用试验（一） 枸橼酸盐利用试验（1）原理当细菌利用铵盐作为惟一氮源，并利用枸橼酸作为惟一碳源时，便可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸钠，生成碳酸钠，使培养基呈碱性。（2）方法将细菌接种于枸橼酸盐培养基的斜面上，在35培养

55、14天，每天观察培养基颜色变化。（3）结果西蒙氏枸橼酸盐培养基斜面上有细菌生长，且培养基变蓝色为阳性；培养7天无细菌生长，培养基颜色不变保持绿色为阴性。柯氏枸橼酸培养基斜面变红色为阳性，保持淡黄色不变色为阴性。（4）应用常用于肠杆菌科细菌各菌属之间鉴别。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属、耶尔森菌属为阴性，枸橼酸杆菌、沙门菌、克雷伯菌属、沙雷菌为阳性。此外，也有助于假单胞菌、气单胞菌的鉴定。（二） 丙二酸盐利用试验（1）原理细菌能利用丙二酸盐作为惟一碳源时，则能分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变碱性。（2）方法将细菌接种于丙二酸盐培养基培养基，置35培养过夜后观察结果。（3）结果培养基由绿色变成蓝

56、色为阳性，无颜色改变是阴性。（4）应用本试验有助于鉴别肠杆菌科细菌。克雷伯菌属和亚利桑那菌为阳性，肠杆菌属、枸橼酸杆菌属和哈夫尼亚菌属有不同生物型反应，其他菌属为阴性。（三） 马尿酸钠水解试验（三氯化铁法）（1）原理某些细菌具有马尿酸水解酶，可使马尿酸钠水解，产生苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸与三氯化铁试剂结合，形成苯甲酸铁沉淀。（2）方法将细菌接种于马尿酸钠培养基中，置35 培养48小时后，离心沉淀， 取上清液0.8ml ，加入三氯化铁试剂0.2ml ，立即混匀，经10 15 分钟观察结果。（3）结果出现恒定的沉淀物为阳性，若有沉淀物出现，轻摇后就消失为阴性。（4）应用B群链球菌能分解马尿酸盐，呈阳

57、性反应，其他链球菌为阴性。（四） 马尿酸钠水解试验（茚三酮法）（1）原理细菌水解马尿酸钠后形成的甘氨酸，在强氧化剂茚三酮的作用下氨基， 生成氨、二氧化碳和醛，茚三酮则生成了还原型茚三酮。氨、二氧化碳与残留的茚三酮起反应，形成紫色化合物。（2）方法将菌液0.4 ml和等量的1马尿酸钠溶液混合后， 于35 培养2小时，加入02 ml茚三酮试剂混匀，出现紫色为阳性。（4）应用B群链球菌能分解马尿酸盐，呈阳性反应，其他链球菌为阴性。四、细菌酶类试验（一） 触酶（过氧化氢酶） 试验（1）原理细菌的呼吸酶使细菌在代谢过程中形成过氧化氢，若细菌同时产生触酶，则可把过氧化氢分解为水和初生态氧，继而形成氧分子出

58、现气泡。（2）方法挑取纯培养环，置于洁净的玻片上或小试管内，滴加适量3过氧化氢溶液。在1分钟内见有大量气泡产生，判为阳性结果。（3）应用葡萄球菌和微球菌属呈阳性，链球菌和肠球菌呈阴性。可用于革兰阳性球菌的初步区分。（二） 氧化酶试验（1）原理氧化酶也称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶。在本试验中，氧化酶并不直接与氧化酶试剂起反应，而是先使细胞色素C 氧化， 随后此氧化型细胞色素C 再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。（2）试剂a 盐酸四甲基对苯二胺1g 、抗坏血酸1g ，水100 ml ，盛于棕色瓶内，避光在4 保存。b 萘酚1g 、95 乙醇95 ml 、盛于棕色瓶内，在4 避光

59、保存。（3）方法a 取滤纸一小块，涂抹菌苔少许，加试剂a，立即呈粉红色，迅速转为紫红色者为阳性。b 在滤纸上先滴加少许试剂a，再滴加等量的试剂b，然后涂抹待测菌，立即呈现蓝色者为阳性，2分钟无颜色变化为阴性。（4）应用主要用于奈瑟菌属和非发酵菌的鉴定，绝大多数菌为阳性，也用于肠杆菌科细菌的确定，该科细菌氧化酶试验都为阴性。本试验也有助于识别气单胞菌和邻单胞菌。注：试剂在空气中易发生氧化，加入抗坏血酸可减缓氧化，未加抗坏血酸的试剂需每星期新鲜配制。实验时避免接触含铁的物质。因葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性，实验菌苔不宜采用含葡萄糖的培养基上的菌落。（三） 硝酸盐还原试验（1）原理硝酸盐培养基中的硝酸

60、盐（NO3） 可被某些细菌还原为亚硝酸盐（N04），后者与醋酸作用生成亚硝酸。亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成偶氮苯磺酸，再与萘胺结合成红色的N-萘胺偶氮苯磺酸。（2）试剂a 甲液：对氨基苯磺酸0.8g ；5 molL 乙酸100 ml 。b 乙液：萘胺0.5g ；5molL 乙酸100 ml 。c 锌粉：少许。（3）方法将待检菌接种于硝酸盐培养基(内置一小倒管)，置35温育1 4 天，每天吸出培养液少许，试验前临用时等量混合试剂甲液和乙液，在培养液中加1 2 滴混合试剂，阳性者立即出现红色。并观察小倒管，如有气泡产生，表示有氮气产生。若加入硝酸盐还原试剂不出现红色，可加入锌粉少许，如出现红色证

61、明产生芳基肼，表示硝酸盐仍存在；如不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氮和氨。（4）应用本试验是细菌鉴定中的重要生化反应。肠杆菌科细菌为阳性反应（极少数例外，如痢疾志贺菌型为阳性）。如铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气。而不动杆菌属均为阴性。（四） 磷酸酶试验（1）原理磷酸酶可使单磷酸酯水解。反应基质若是磷酸酚酞，经该酶水解后可释放出酚酞，在碱性条件下呈红色。（2）方法将被检细菌接种磷酸酚酞平板上，置35培养18 24 小时，在平板盖内加1 滴浓氨水熏蒸片刻。观察菌落，呈粉红色为阳性。（4）应用本试验有助于致病葡萄球菌与其他葡萄球菌的鉴别，前者呈阳性，后者呈阴性。（五） 凝固酶试验（1）原理致病性葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原变成纤维蛋白而附着于细菌表面，发生凝集。葡萄球菌产生的凝固酶有两种，一种是结合凝固酶， 结合在细胞壁上，可用玻片法测出。另一种是游离凝固酶，此酶生成后释放于培养基中，可用试管法测出。（2）方法a 试管法：于无菌试管内加入兔血浆0.5ml ，再加入葡萄球菌16 18 小时肉汤培养物0.5 ml ，轻轻转动试管，使混匀。置37 水浴中3 4