丙型肝炎论文基因治疗论文：CTE-RHA复合核酶抑制HCVRNA复制的研究

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1、l 论文发表专家一）中国学术期刊朋wwv/丙型肝炎论文基因治疗论文：CTE-RHA 复合核酶抑制 HCVRNA【摘要】目的复制的研究建立 hcv 亚基因复制子稳疋转染和表达的细胞株；探讨核酶和核酶-cte 复合物对 hcv rna 的影响。方法 在脂质体介导下，经 g418 筛选抗性克隆，建立 hcv 亚 基因复制子稳定转染细胞系。用rt-pcr 证实转染成功。观察四种核酶对 hcv 亚基因复制子稳定转染细胞中 hcv rna 的 影响。结果 两种复合核酶转染组扩增目的条带亮度明显低于对应普通核酶转染组。结论新型复合核酶（带有 cte）在细胞内的切割靶 rna 的效率明显高于普通核酶。【关键词

2、】丙型肝炎 核酶 基因治疗丙型肝炎病毒是单股正链 rna 病毒，是引起病毒性非甲 非乙肝炎和输血后肝炎的重要病原体。核酶是一类能对特定 序列的 rna 进行切割、具有催化功能的小rna 分子。通过核酶技术抑制 hcv 的复制和表达已经成为近年来的研究热点。warashina m 等3报道将核酶联接到 d 型逆转录病毒的胞浆转运信号序歹 U cte（constitutive transport element）后，由于 cte 具有解旋酶 a（rha）的结合序列，rha 能与 cte 结 合，使核酶能到达任何需要切割的位点。我们通过建立hcv亚基因复制子的稳定转染细胞株，并根据现有文献分别针对

3、hcv5-ncr 序列最易（195 位点）和最难（150 位点）切割的B顾中国学术期刊洌wwv/位点设计相应的核酶和带有cte 的新型核酶，观察在细胞内各自对 hcv rna 的切割效率，比较各自对相应位点的切割效率以及新型核酶和普通核酶的切割效率有无差异，为丙肝的 有效治疗提供新的思路。1 材料与方法 1.1 材料与试剂人肝细胞株 qsg7701，prc/cmv 为空载体，pbm4-5 hcv，细菌 jm109 菌株由本实验室保存，dmem 高糖培养基(gibco 公司)，胎牛血清(四季青公司)，g418 筛选剂。弓 I 物：B-actin(592bp)上游引物：5-ccaaggccaacc

4、gcgagaagatgac-3下游弓丨物：5-agggtacatggtggtgccgccagac-3由北京奥科生物科技公司合成ns5a(314bp)上游引物：5-cactcccctgtgaggaactactgt-3下游引物：5-cgagctcatgatgcacggtc-3由长沙瑞晶生物公司合成oligo(dt)18由长沙瑞晶生物公司合成1.2 稳定转染细胞的制备分别将扩增后提取的质粒pbm4-5 hcv 和空白质粒_论文发表专家一顾中国学术期刊洌wwv/prc/cmv 转染 qsg7701 细胞，继续细胞培养，然后加入含筛顾中国学术期刊洌wwv/选剂 g418 的正常培养基进行筛选，对细胞进行

5、换液、消化传代 1 月，再对阳性克隆米取 rt-pcr进行鉴定获得稳定表 达hcv-rna 的 qsg7701 细胞。1.3 核酶对 qsg7701 细胞中 hcv rna 表达的影响 按照Iipofectminetm2000说明书中的转染程序，分别将新型核酶和普通核酶的四种质粒分别导入细胞。细胞分为七组：空白对照组 1（不加质粒）、空白对照组 2（转染空载 体prc/cmv）、转染 pphcv5-r1 组、转染 pphcv5-r2 组、转染 pphcv5-cr1组、转染 pphcv5-cr2 组、阴性对照组（正常 qsg7701 细胞）。转染前一天，将适量细胞消化接种于6 孔培养板，待细胞贴壁且密度达 70%左右时进行转染，每孔用量：质粒dna2ug+脂质体6ul。转染48小时后取细胞进行下一 步实验rt-pcr，观察各质粒对 hcv rna 表达的影响。以2 结果 2.1 稳定转染细胞组 rt-pcr 鉴定图 12 稳定转染细胞组 rt-pcr 鉴定m dna ladder;1:正常 qsg7701 细胞（作为阴性对照）；2:空白质粒转染组；3:目的质粒转染组；4:以质粒 dna 为模板进行_论文发表专家一B-actin 为内参，观察各质粒对hcv rna 表达有无影响。顾中国学术期刊洌wwv/pcr 组（作为 pcr 阳性对照）（各细胞组均以B-actin 为内对照）