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1、微生物限度检查标准操作规程 1.目的：建立微生物限度检查的基本操作，为微生物检查人员提供正确的操作规程。 2.依据：中华人民共和国药典2010年版二部。中华人民共和国卫生部药品卫生检验方法 3.范围：本标准适用于QC化验室的微生物限度检查。 4.职责：QC微生物检验员对本标准的实施负责。 5.程序： 5.1.定义：微生物限度检查法：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。 5.2.实验用具：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 5.3.培养基： 5
2、.3.1.营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、麦康凯琼脂培养基、枸橼酸盐培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、蛋白胨水培养基、4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸（MUG）培养基。 5.3.2.培养基的管理、配置应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配置规程。 5.4.试液：甲基红试液、a-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。 5.5.稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 5.6.供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入试管中，加入适量的稀释剂制成1：10浓度的供试品溶液。 5.7.对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试
3、验，对照菌株为大肠杆菌CMCC（B）44102。 5.8.检查法：除另有规定外，细菌的培养温度为30-35，霉菌的培养温度为23-28，控制菌的培养温度为35-37C。 5.8.1.细菌、霉菌计数： 5.8.1.1.平皿法采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续23个稀释级的供试液。 取供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中，注入1520ml温度不超过45C的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。阴性对照试验取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个
4、平板，平均不得有菌生长。 5.8.1.2.培养和计数除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以48小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至57天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂
5、培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。含蜂蜜、王浆的液体制剂，用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。 5.8.1.3.菌数报告规则宜选取细菌、醇母菌平均菌落数在30300之间的稀释级，霉菌平均菌落数在30100之间的稀释级，作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。 (1)当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。
6、(2)当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值(比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值)而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于5但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于供稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。 (3)当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。 (4)如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释
7、倍数的值报告菌数。 5.8.1.2.薄膜过滤法采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于0.45um,直径一般为50mm。选择滤膜材质时应保证试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液供试液过滤前先将将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。每片滤膜的总过滤量不宜过大，以避免滤膜上的微生物受损伤。取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加
8、至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品每1g或1ml所含的菌数较多进，可取适宜稀释级的供试品每1ml，过滤。用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“计数方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面赶朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。阴性对照试验取试验用的稀释渡1ml,照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 5.8.1.3.培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。5.8.1.4.菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；
9、若滤膜上无菌落生长，以1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1ml供试品)，或1乘以稀释倍数的值报告菌数。 5.8.2.大肠埃希菌(Escherichiacoli)取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cmJ,直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中，培养1824小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物0.2ml,接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈
10、试液本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。5.8.2.1.如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性,则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1824小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。表1大肠埃希菌菌落形态特征咖氓甘培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑,湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌洛中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润
微生物限度检查标准操作规程
