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1、郑老师，这是我的安排星期四上午准备试剂与各种器械的灭菌，制备培养基星期四下午活化菌种与斜面琼脂星期五上午接种于LB培养基中，37C培养星期五卜,午星期六上午涂片检查有无杂菌污染，然后冷冻干燥保存。星球六下午这个时间只是初步的，郑老师您看行不行，我现在除了周二有课外其它差不多都没课了。还有，我也不知道这个安排合不合适，有什么问题，还请老师指出来。步骤:1各种物品的准备与高温蒸汽灭菌2菌种的培养：LB液体培养基24H3离心4有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来 制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过 氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来
2、稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、 血清、糖类、甘油、二甲亚飒等。5真空冷冻干燥。大肠杆菌的冷冻真空干燥法【试剂与器材】1 .2.3.4.菌种：保存的大肠杆菌培养基：LB液体培养基溶液或试剂：脱脂奶粉仪器或其他用具1ml枪头、无菌滴管，冻干管（青霉素瓶），普通冰箱， 低温冰箱（-30C）、离心机、离心管、锥形瓶、试管、灭菌锅、烘干箱等【操作步骤】口1 、.准备冻干管：青霉素瓶（5ml）用蒸馏水冲洗12次，加四层纱布封口后，121C灭菌30min备用。配制保护剂：将脱脂奶粉配成10%乳液,115C，灭菌10min，随机抽样进行无菌检查，确认无菌后方可使用。3 .培养菌种：将要保存的菌种接入LB斜
3、面培养基中，361口培养24h后，镜检后转接LB液体培养基361 口 培养 24h.4.离心（细胞收集）：将长好菌的液体培养基分装灭过菌的离心管，6000转/分10min.。，加保护加：每100ml培养基离心出的细胞加入5-10ml保护液混匀。6、分装样品：用灭过菌的1ml枪头吸取加过菌的保护剂，注入到冻干管中，每管装约2ml。7 心,山一.预冻：将加好保护剂的冻干管盖上胶盖封上纱布放于饭盒中，置于-30C冰柜冷冻24h-48h即可。8 .冷冻真空干燥：启动冷冻真空干燥机制冷系统。当温度下降到-50C以下时，将冻结好的样品在无菌条 件下打开胶盖（不拿下来，留一个缝隙即可）封好纱布，迅速放入冻干
4、机钟罩内，启动真空泵抽气直至样 品干燥（约24h）。9.取出样品：先关真空泵、再关制冷机，打开进气阀使钟罩内真空度逐渐下降，直至与室内气压相等后 打开钟罩，取出样品。先取几只冻干管在桌面上轻敲几下，样品很快疏散.说明干燥程度达到要求。若用 力颠，样品不与内壁脱开，也不松散，则需继续冷冻真空干燥，此时样品不需事先预冻。1.熔封用高频电火花真空检测仪检测冻干管内的真空程度。当检测仪将要触及冻干管时，发出蓝色电 光说明管内的真空度很好，便在火焰下（氧气与煤气混合调节，或用酒精喷灯）熔封冻干管。（青霉素瓶不 用这步）11心.、.检测存活性每个菌株取1支冻干管及时进行存活检测。打开冻干管，加入0.2m1
5、无菌水，用毛细滴 管吹打几次，沉淀物溶解后（丝状真菌、酵母菌则需要置室温平衡30 min60min），转入适宜的培养基培养， 根据生长状况确定其存活性，或用平板计数法或死活染色方法确定存活率，如需要可测定其特性。12 件财一13.保存 置4C或室温保存（前者为宜）。隔时进行检测。.取用冻干管时，先用75%乙醇将冻干管外壁擦干净，再用砂轮或锉刀在冻干管上端画一小痕迹，然 后将所画之处向外，两手握住冻干管的上下两端,稍向外用力便可打开冻干管，或将冻干管近口烧热，在热 处滴几滴水，使之破裂，再用镊子敲开。【注意事项】样品干燥的程度对菌种保存的时间影响很大。一般要求样品的含水量为1%3%，判断方法: 外观样品表面出现裂痕，与冻干管内壁有脱落现象，对照管完全干燥；指示剂用30g/L的氯化钻水溶液 分装冻干管，当溶液的颜色由红变浅蓝后，再抽同样长的时间即可。
大肠杆菌的冷冻干燥保存1
