DNA微阵列技术介绍及其应用
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1、DNA微阵列技术介绍及其应用DNA微阵列技术(microarray)指在固体表面(玻璃片或尼龙膜)上固定成千上万DNA克隆片段,人工合成的寡核苷酸片段,用荧光或其他标记的mRNA,cDNA或基因组DNA探针进行杂交,从而同时快速检测多个基因表达状况或发现新基因,快速检测DNA序列突变,绘制SNP遗传连锁图,进行DNA序列分析等的一种新技术,其基本原理是基于Southern杂交或斑点杂交技术。将DNA微阵列称为基因芯片实际上是不确切的。生物芯片(bioship)属于分子生物电子学范畴,只采用DNA或蛋白质等生物高分子为骨架制成大规模集成电路,用于研制第六代智能计算机。DNA微阵列有两种基本形式,
2、即点样型DNA微阵列和原位合成型DNA微阵列。点样型DNA微阵列,通过PCR扩增的上万个DNA克隆,或常规合成的寡合苷酸被点样固定在一定固体表面(玻璃片,尼龙膜),用一组标记探针单独或混合处理检测。制备方法:采用常规技术制备DNA,用点样仪自动点样在玻璃片上。1制备DNA片段:采用特异引物从各个克隆进行PCR扩增或将基因组DNA克隆到通用载体,然后纯化后重悬浮于3*SSC,使终浓度为05ug/ul2微阵列制作:玻璃片清洗,包被多聚赖氨酸(35ml多聚赖氨酸,35mlPBS,280mlddH2O),双蒸水冲洗,干燥。用微阵列仪点样,每种样品放5nl,用介层连接确定其互补序列。制备方法:可改装一台
3、半导体光印刷仪,采用光导向结合化学原理合成各种寡核苷酸探针。1.玻璃片清洗后包被一层多聚赖氨酸。2.在玻璃片上每个一定间距连接上带有光不稳定保护基的羟基。3UV照射,通过光印刷仪的遮盖膜使UV只穿过特定微孔射向玻璃片,将孔下的光不稳定保护基除去,产生自由羟基。4.加入5端带光不稳定保护基的磷酰胺碱基与自由羟基连接。5.使遮盖膜微孔对准邻侧另一光不稳定保护基,重复4.5.依次有序进行,第一层碱基连接完毕后再进行第二层第三层。核苷酸探针的排列组成必须严格有序。靶DNA与微阵列杂交及荧光标记检测:在检测靶基因不同表达水平时,常用一组不同荧光标记的mRNA和cDNA探针进行杂交。探针与微阵列在65度杂
4、交16小时,依次用05*SSC,001%SDS,0006*SSC在室温下洗5min,除去未结合探针。然后用连接电脑的倒置扫描共聚焦显微镜阅读微阵列,扫描和资料分析。一般采用分析红色和绿色荧光杂交强度和比例的软件分析。DNA微阵列技术的应用一,检测基因表达水平及识别基因序列。Schena等1996年用拟南芥光调基因微阵列,以不同器官中的mRNA为探针,检测其基因表达水平,结果表明叶mRNA的表达水平是根的500倍。Shelon等1996年将酿酒酵母基因组DNA克隆制成微阵列,用6条最大染色体和10条最小染色体DNA探针分别标记上红,绿荧光标记进行杂交检测,结果表明95%的克隆在染色体上的定位与文
5、献报道一致。Milosajevic等1996年将大肠杆菌基因组DNA的15328个克隆制成微阵列,用997众寡核苷酸探针进行杂交检测,汇总结果通过计算机与Ecoli序列资料库相比较,用此技术一次可识别46MbDNA序列结构。二,检测表达状况,发现新基因。Wodicka1997年将覆盖酵母基因组全部ORF的26万种25mer探针,阵列于4张玻片,每张65万个探针,将酵母分加富和低限两组培养,研究不同生长条件下基因表达水平,结果表明90%的基因在两种条件下均表达,36种mRNA更多地在加富培养下表达,140种mRNA在低限培养中表达。此外,还发现了一批未见报道的新基因。三,检测突变和多态性进行遗传
6、作图。Hacia等1996年用96600寡核苷酸阵列,检测人癌基因BRCA1突变情况,将15个患者样品和对照样品分别用两种荧光标记,发现14人的该基因发生了一个剪辑突变,共出现8种多态性,突变表现在该基因外显子2的第22个密码子内。利用SNP制作人类遗传图谱,将是第三代遗传图谱,此技术完全以DNA微阵列为基础。四,DNA序列分析。Donnel等1992,Pease等1994,Yershow等1996,Wallraff等1997都报道了采用DNA微阵列技术进行DNA序列分析。多数研究者采用先合成寡核苷酸序列制作微阵列,然后与标记的未知DNA序列杂交,通过荧光共聚焦显微镜扫描,计算机软件分析得出数据,也有研究者将被测DNA片断阵列,以标记的寡合苷酸为探针杂交测序。
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