Beutler改良法测定组织GSH操作规程
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1、Beutler改良法测定组织GSH操作规程一、 原理及意义原理:DTNB能被-SH基团还原,产生等克分子的2-硝基-5-巯基苯甲酸,而苯甲酸阴离子在一定PH值条件下呈黄色,在412 nm波长下有吸收峰。意义:还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一种低分子自由基清除剂,它可清除O2 、H2O2、LOOH。GSH是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种小分子肽,是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物,并且是谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)两种酶类的底物,为这二种酶分解氢过氧化物所必需,能稳定含巯基的酶和防止血红蛋白及其它辅因子受氧化损伤,最近还证明GSH也参与使Vi
2、t E恢复到还原态的作用。GSH测定值的高低可间接反映机体发生氧化损伤的程度。二、 器材可见光分光计、7 ml离心管和管架、加样器和枪头三、 试剂 1 mmol/L的GSH(标准品); 1柠檬酸钠; 二硫双基苯甲酸(dithio-bis-nitrobenzoicacid, DTNB)试剂:用1柠檬酸钠配成终浓度0.04(w/v); 20三氯醋酸; 0.3 mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)缓冲液。四、 步骤1、样品处理及试验步骤(下面以肝脏组织为例)称取一定量的肝脏组织于冰冷0.85生理盐水中漂洗,滤纸吸干表面水分,烧杯内剪碎 制备20%组织匀浆液(须用0.85生理盐水或三蒸水) 4000
3、 g离心10 min后取上清液 按上清液:20三氯醋酸(体积比)为2:1混合(加TCA前留取20 l上清液用于Lowry法测蛋白) 混匀,4000 g离心10 min(此步离心要充分,可适当提高离心力) 收集上清液按表2测定。2、按下表1绘制标准曲线(单位:ml)表1 GSH标准曲线的测定GSH(mol/L)010203040501 mmol/L的GSH00.050.10.150.20.25三蒸水0.50.450.40.350.30.25磷酸盐缓冲液4.04.04.04.04.04.0DTNB试剂0.50.50.50.50.50.5混匀,5 min内于412nm比色,以三蒸水调零,以标准GSH
4、浓度为X轴,相应吸光值为Y轴,绘制标准曲线,并求回归方程。3、按下表2操作测定样品GSH(单位:ml)表2 Beutler改良法样品测定操作试 剂测定管空白管待测样品液0.10磷酸盐缓冲液4.44.4DTNB试剂0.50.5三蒸水00.1测得的吸光值代入回归方程,可计算出样品液的GSH浓度。五、 实验结果1、标准曲线结果GSH浓度(mol)00.050.10.150.20.25A值0.0000.1260.2600.3940.5290.666根据上数据测得标准曲线方程为:X(mol)=0.3744898 Y+0.0017227(其中Y为吸光值,标准曲线看Figure 1)Figure 1 GSH标准曲线图六、 注意事项 样品应冰上匀浆,所有步骤尽量保证低温下操作,否则结果偏低; 所有用水均需三蒸水,否则结果偏低; 未经蛋白变性处理的样品在20不宜存放; 反应管内最终PH值必须保证在8.09.0间,否则结果不稳定; 配好的DTNB应在有限期内使用(4下可存1个月); GSH浓度低时显色快,消退也快;浓度高时显色慢,消退也慢,一般反应15 min后测定(最好不要超过5 min); 反应总体积可调为2.5 ml。
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