铁盐比色法

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1、测定方法:配置一定浓度的原花青素乙醇溶液，取ImL加至具塞刻度试管中，加入9mL正丁 醇一盐酸混合液，于99C士 1C条件下加热40mni,迅速冷却，于550nm下比色，按照标准 曲线定量。目前这种方法已被广泛地用于测定食品中诸如花色素普、原花青素等缩合单宁物 质的含量。然而Harinder通过酸解后的核磁共振检测技术验证后指出，该法利用酸水解缩 合单宁时，并不能将所有的缩合单宁分解产生有颜色的花色素，从而使测定的结果偏低。取1.0 mL样液(或原花青素溶液)于10 mL刻度试管中，加入6.0 mL正丁醇-浓盐酸 (95 ：5)与2 %硫酸铁铵溶液(溶解于2 mol/L盐酸)0.2 mL,混匀

2、，置于沸水浴中加热 40 min 后,立即取出用冰水快速冷却至室温，在550nm处测定吸光值。(1) 测定的最佳条件为:体系含水分3%4%，盐酸浓度06mol/L,FeNH SO ) 0 608g/L,4(4 2反应介质为正丁醇，时间40min,温度(991) C (沸水浴)，实际操作时可将正丁醇、浓HC1、 0 2 kg/L FeNH (SO ),按照 V(正丁醇):V(浓 HCl) : V(0 2kg/L FeNH4(S04)2)=85 ： 5 ： 0 444 2的比例预先混合后一次加入。(2) 测定的最低检测限制为4 0p g,原花青素浓度为26 0416 0p g/mL时,与吸光值线

3、性相关，相关系数r=0 -9993,加标量为52 00208 0p g/mL时，回收率为90 64%109 5%,RSD 为213%298%。移取1.0 mL原花青素标准液或样品溶液于10 mL刻度试管中，加入9.0 mL比为83:6:1 的正丁醇：浓HCl:10%硫酸铁铵反应混合液，塞紧塞子，摇匀，置于沸水浴中加热40min 后，立即取出用冰水快速冷却4min5min,取出，待恢复至室温(约15 min),在550 nm 处以试剂空白调零，测定吸光值OD550,显色后2 h内稳定。线性范围为10 p g/mL200 p g/mL,最低检出浓度为3 p g/mL。分别移取土述不同浓度系列使用液

4、l.00mL于10mL刻度试管中，加入9mL正丁醇:浓 HCL:20%FeNH;(504):(85:5:0.4, v/v)混合液，置于沸水浴中加热，待水浴温度恢复至99 士 1C时开始计时，并塞上塞子(勿摇)，准确加热4Omin后，立即取出用冰水快速冷却至室 温，以ll:丁醇定容至刻度线，塞紧后充分摇匀，在550nm处以空白管调零，测定吸光值0D55。， 并以最小二乘法绘制原花青素浓度(p g) 一吸光值OD曲线。550溶液中原花青素浓度在26.00 一 416.00p g/mL,范围内。1. ( 1)正丁醇一盐酸(95:5)溶液制备:制备lL此试剂，用移液管吸取50mL37%的浓盐酸，加 入

5、1L的烧瓶内，再加正丁醇到1L的刻度线，然后转移到刻度瓶，室温储存不超过1年。(2) 2mol/L盐酸制备:制备1L此试剂，用移液管吸取167mL37%盐酸，加入1L烧瓶内，再加 去离子水到1L的刻度线，然后转移到刻度瓶，室温储存不超过1年。(3) 2%(w/v)硫酸高铁铵(12H20)2mol/L盐酸溶液制备:制备lL此试剂，称取20g硫酸高铁铵 (12H2O)，放入500mL烧杯，加入大约400mL2mol/L盐酸溶解它，转移此溶液到1L烧瓶，用 2mol/L盐酸水溶液冲洗烧杯3次，转移冲洗液至此烧瓶，加2mol/L盐酸至1L的刻度线， 充分振摇，转移此溶液到刻度瓶，室温储存不超过1年。2

6、. 标准样品制备2mg/mL花色素溶液制备:精确称取0.01mg花色素，加入5mL烧瓶，用乙醇溶解。3. 总原花青素含量测定吸取0.5mL样品制备液，加入到15mL具塞玻璃试管。加6mL正丁醇一盐酸(95:5)溶液，再 加入0.2mL2%硫酸高铁钱溶液，混合均匀。密封试管，在95 士 0.2C水浴加热40min。显色 后在10min内冷却到室温。立即用分光光度计在55Onm比色测定。吸光度值控制在0.2 一 0.8范围内。原花青素含量(%)=mV xd/1000xGxV x (l 一 w) x 100%式中:m查工作曲线，标准液OD对应的原花青素的含量，mg;550V待测定样品液的取样体积，m

7、L;V2样品溶液的体积，mL:G样品质量，g;w样品的含水量，%;d样品溶液稀释倍数。葡萄籽原花青素溶液：取葡萄籽原花青素粉末5 mg溶于10 mL蒸憾水中，分别稀 释配制浓度为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05 mg/mL的标准液。硫酸铁镀溶液：称取0.2gNH4Fe(SO4)212H2O,用2 mol/L盐酸配制成2%的硫酸铁 鞍溶液。正丁醇盐酸溶液:用正丁醇溶液95 mL以及盐酸5 mL配制成100 mL正丁醇-盐酸 溶液。1.4.3.2标准曲线的制备以葡萄籽原花青素为标准品，分别配制浓度为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 0.05 mg/mL 的标准液，釆用正丁醇-

8、盐酸法(Feng, et al., 2003),取其1 mL移入10 mL带塞试管 中，然后依次加入0.2 mL硫酸铁钱溶液和6 mL正丁醇-盐酸溶液，摇匀。反应液于 95-97 C水浴中冷凝回流40 min后，用冷水迅速冷却，在546 nm波长处测定其吸光度， 以乙醇代替样品作为空白对照，根据吸光值与浓度对应关系绘制标准曲线，回归方 程为：Y=2.1892X+0.0708, R2=0.9989Y； 546 nm所测的吸光值；铁盐催化法：取1.0 mL样液(或原花青素溶液)于10 mL刻度试管中，加入6.0 mL正丁 醇-浓盐酸(95 : 5)与2 %硫酸铁铵溶液(溶解于2 mol / L盐酸

9、)0.2 mL,混匀, 置于沸水浴中加热40 min后，立即取出迅速冷却至室温，在550nm处测定吸光 值。以原花青素标准曲线计算被检测样品原花青素的含量：w% = m /20 x ( A + 0. 0026) x 5 /2. 636 x 100% ( 1)式(1)中:w为原花青素提取率(%);m为提出物质量(g)；A为吸光度值。原花青素含量（D）：x 100%V x C x nD=W式中，v为试样定容体积（mL）,C为试样中原花青素浓度（mg/mL）, n为稀释倍数，W为试样重量（g）。薄层层析（TLC）1【含义】薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。

10、把欲分离的样品点在薄层 上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。2【应用】薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测 定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。3【分类】根据分离的原理不同，薄层层析可以分为两类：用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析；用纤维素粉、 硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析。薄层层析中以吸附薄层为多用，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和 硅胶。4【原理1】吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分 离。吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受 被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。5【原理2】分配薄层层析的原理是，用极性溶剂吸苷在固体支持剂上所形成的混合物，铺成薄层（或装柱），然后活化、点样（或 上样），再用极性较弱的展开剂（或洗脱剂）进行展开。在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配。由于 各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。