重庆应用基础研究项目申请书重庆科委

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1、 (一)、立项依据项目研究的重要性、必要性（2000字以内）人口老龄化是全世界面临的重大课题。我国人口年龄结构在2000年即跨入老年型，比世界总体人口年龄结构提前了10年左右，据预测到2050年，60岁以上人口的比例将由2000年的10.3上升到35左右。重庆人口老龄化也十分严重，根据重庆市老龄委办公室的数据，我市60岁以上人口超过465万，占全市人口总数的15%，这个比例远远高于全国老龄化平均水平。人口老龄化为医疗保障事业提出了严峻的挑战，如何更有效地预防衰老和防治老年性疾病，是迫切需要解决的科研和社会问题。衰老是全身性的、多方面的、十分复杂的、循序渐进的退化过程，研究表明基因调控在衰老过程

2、中发挥着重要的作用。近年来抗衰老基因在老年疾病中的发病机制研究逐渐成为老年医学研究的热点。在众多抗衰老基因中，Klotho基因被认为是最理想的抗衰老基因之一1。Klotho基因于1997年由Kuro在研究转基因小鼠时发现。Klotho表达缺陷的小鼠表现出几乎全部与人类衰老类似的表型，如寿命缩短、不育症、动脉硬化、皮肤萎缩、骨质疏松、肺气肿等，给予基因补救治疗后其衰老表型可得到明显改善并延长寿命，提示Klotho基因的表达产物具有抗衰老作用，因而被研究者用希腊神化中掌管生命之线女神Klotho来命名。Klotho基因可通过其表达蛋白发挥激素样作用，通过调控多种细胞信号转导，激活离子通道受体等途径

3、发挥改善胰岛素抵抗和对抗氧化应激，起到抗衰老及预防老年疾病的作用24。上调Klotho基因表达是预防衰老和防治老年疾病的新途径。人类Klotho基因变异可明显增加年龄相关疾病的患病率。人类90的基因变异来源于单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）5，近年研究发现Klotho基因有多个SNP位点与临床疾病具有遗传关联。由于Klotho基因是遗传上相对保守的基因，位于编码序列的SNP往往发生在特定的人群，如根据NCBI数据显示（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=9536314），代表编码序列

4、常见SNP位点的KL-VS在中国汉族人群及日本人群频率为零。位于Klotho基因调控序列的SNP在疾病发生中有更重要的意义。既往对于调控序列主要集中在G-395A多态性，发现该位点与骨质疏松、冠状动脉狭窄、高血压、认知功能障碍、脑血管疾病等均有相关性，而且通过凝胶电泳迁移率（EMSA）分析显示该位点G/A替换后可影响DNA和蛋白的结合6。但既往研究多是针对临床疾病的基因流行病学调查，单一SNP单一人群的研究对不同人种间遗传背景的差异不够重视，针对SNP位点的功能研究不够深入。我们前期工作中发现，在重庆汉族人群中Klotho基因G-395A多态性与动脉僵硬度增高有相关性4，初步的功能分析提示G-

5、395A可能是潜在的具有调控意义的SNP位点（regulatory SNP， rSNP）,对这一SNP位点进行功能分析，明确该位点在Klotho基因表达调控中的作用及其机制，有助于老年疾病的早期预防，并为抗衰老药物靶点提供新的理论依据。主要参考文献：1 Wang Y, Sun Z. Current understanding of klotho. Ageing Res Rev. 2009, 8(1):43-51. 2 Russell SJ, Kahn CR. Endocrine regulation of ageing. Nat Rev Mol Cell Viol. 2007,8:681-91

6、3 Kuro-O M. Klotho and aging. Biochim Biophys Acta. 2009 Feb 18. Epub ahead of print 4 Kuro-o M.Klotho as a regulator of oxidative stress and senescence.Biol Chem. 2008,389(3):233-41. 5 Bahlo M, Stankovich J, Speed TP, et al. Detecting genome wide haplotype sharing using SNP or microsatellite haplot

7、ype data. Hum Genet, 2006, 119:38-50.6 Kawano K, Ogata N, Chiano M, et al. Klotho gene polymorphisms associated with bone density of aged postmenopausal women. J Bone Miner Res 2002,17:17441751.7 王虎林, 司良毅, 孙兰英, 等. Klotho基因G-395A多态性与动脉硬化的相关性研究. 中华老年心脑血管病杂志,2008,10: 96-98.(二)、研究现状和发展趋势目前研究现状和发展趋势（重点项目

8、需附查新报告）单核苷酸多态性是人类基因组中分布广泛、密度高、易于批量检测且相对稳定的第三代遗传标记，在疾病易感性、药物敏感/抵抗研究中发挥着越来越重要的作用。由于SNP在基因组中不仅仅是定位标记，有一定数量的SNP直接影响了基因表达调控及蛋白活性。近年来SNP与疾病遗传关联研究急剧增加，如何更好的利用这些研究结果成了当前一个重要课题。与编码序列的SNP相比，非编码序列中SNP密度更高，其中有不少具有调控意义的SNP。对于调控性SNP进行深入的功能分析是当前研究的一个重要趋势1。在对Klotho基因的SNP研究中，有多个SNP位点与老年疾病有遗传关联。其中位于5侧翼的G-395A多态性位点在体外

9、实验显示，G/A替换后的DNA序列结合核蛋白能力有差异，近年来逐渐受到重视。已有研究表明G-395A多态性在特定人群中与骨质疏松、冠心病、高血压、脑血管病、认知功能障碍有相关性2-5，在汉族人群中我们也发现G-395A位点与动脉僵硬度有相关性。这些临床疾病关联研究显示该位点在多种老年疾病中有重要意义，但该位点对Klotho基因表达调控的影响到目前为止尚不清楚，针对该位点的功能研究尚未见报道。通过生物信息学分析显示Klotho基因的5侧翼区无典型的TATA盒，其表达调控方式目前仍然不清楚。通过firstEF（http:/rulai.cshl.org/tools/FirstEF/）及promote

10、r scan （http:/www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/）等启动子预测工具，分析其启动子可能位于Klotho基因5侧翼约-500bp范围内，其中存在5个SP1结合位点，符合缺少TATA盒的启动子缺点。我们近期根据这5个SP1结合位点设计PCR引物进行了启动子删减分析，成功构建了4个启动子缺失突变的报告基因载体，与内参载体共转染HEK293细胞及hela细胞，报告基因活性检测显示在-300bp-500bp存在启动子活性的序列。G-395A位点也处于区域，由于体外G/A替换可使该位点所在序列核蛋白结合能力有差异，我们提出G-395A这个SNP位点是潜在

11、调控性SNP位点的假说。运用Genomatix（http:/www.genomatix.de/cqi-bin）及MAPPER（http:/mapper.chip.org）等转录因子结合位点预测工具分析发现G-395A位点碱基变异可能影响MZF1、ppar、E2F三个转录因子的结合，但哪个转录因子的结合受到影响及影响程度未经实验证实，细胞水平的验证也未见报道。本项目拟在原工作基础上，进一步完善启动子序列删减分析和双报告基因活性检测，对G-395A位点进行功能定位，确认该位点是处于核心启动子区域，还是在增强子、沉默子等调控元件序列中。根据生物信息学的预测，运用EMSA结合单克隆抗体实验，对G/A替

12、换可能影响的转录因子进行预测。针对确认的转录因子，运用其表达载体共转染和序列特异性RNA干扰技术，从正反两方面证实G-395A的功能。主要参考文献：1 Chorley BN, Wang X, Campbell MR, et al. Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies. Mutat Res. 2008,659(1-2):147-57。2 Imamura A

13、, Okumura K, Ogawa Y, et al. Klotho gene polymorphism may be a genetic risk factor for atherosclerotic coronary artery disease but not for vasospastic angina in Japanese. Clin Chim Acta. 2006, 371(1-2):66-70.3 Rhee EJ, Oh KW, Yun EJ, et al. Relationship between polymorphisms G395A in promoter and C1

14、818T in exon 4 of the KLOTHO gene with glucose metabolism and cardiovascular risk factors in Korean women. J Endocrinol Invest. 2006,29(7):613-8.4 Rhee EJ, Oh KW, Lee WY，et al. The differential effects of age on the association of KLOTHO gene polymorphisms with coronary artery disease. Metabolism. 2

15、006,55(10):1344-51.5 王虎林, 肖航, 司良毅. Klotho基因与心血管病的关系及研究现状. 中华老年心脑血管病杂志, 2007, 9: 136-138.（三）、拟解决的主要科学问题详细阐述所要解决的主要科学问题内涵项目组在前期工作中注意到SNP与临床疾病的遗传关联研究因不同人种的遗传背景结果有一定差异，因而选择G-395A在重庆人群中做了分析，结果提示G-395A与动脉僵硬度有相关性。明确该位点仅仅是一个遗传标记还是具有调控作用SNP，对Klotho相关的多种老年疾病研究有重要意义。因此本项目拟进一步明确G-395A在启动序列中的顺式元件作用，阐明在细胞水平该位点对基因

16、表达调控的影响及其机制。通过研究为Klotho基因的表达调控研究提供新的线索，也为防治Klotho基因相关的多种老年疾病提供新的思路，为老年疾病治疗提供新的药物作用靶点。（四）、主要研究内容研究内容要围绕科学问题拟定，要突出重点，避免分散或拼盘现象。1.进一步完善启动子序列删减分析，确定Klotho基因的核心启动子，对G-395A位点进行功能定位。前期结果提示G-395A多态性位点所在的约200bp序列有启动子活性。下一步拟继续对Klotho基因5侧翼-300bp至-500bp的这个片断进行缺失突变，构建报告基因载体，通过报告基因活性检测明确G-395A位点是否处于核心启动子位置，或者是否具有

17、增强子或者沉默子作用。2. EMSA结合单克隆抗体分析，明确其G/A替换影响的转录因子，对G-395A位点进行功能预测。通过HEK293细胞核蛋白与生物素标记的DNA探针进行作用，电泳显影分析，再用MZF1、ppar、E2F抗体进行超迁移反应，明确G/A替换对DNA探针与核蛋白相互作用的影响，明确G/A替换影响的转录因子。3.转录因子表达载体共转染及位点特异性RNA干扰，从正反两方面验证G/A替换对基因转录的影响。根据第2步确认的转录因子，购买或自行构建其表达载体，与含Klotho基因启动子的报告基因载体共转染HEK293细胞，明确上调转录因子表达后G/A替换对Klotho基因启动子启动活性的

18、影响。构建特异性的RNA干扰载体，经共转染实验比较启动活性。以上可从正反两方面验证特定转录因子的作用。（五）、总体研究方案阐述学术思路、技术路线、与国内外同类研究相比的创新点与特色、可行性分析等。1. 学术思想：由于Klotho基因G-395A多态性与多种老年疾病有遗传关联，而该SNP位点又位于启动子区域，文献报道该位点的变异可引起与核蛋白结合能力的差异，因而我们提出G-395A位点是个潜在调控性SNP位点的假说。通过实验证实G-395A位点对转录因子结合的影响，并对所影响的转录因子进行鉴定，则可以明确该位点在Klotho基因表达调控中的作用，为人群中Klotho相关老年疾病的防治提供线索。而

19、该位点有望成为新的药物作用靶点，为从基因水平上预防和治疗老年病提供新的理论支持。如下图所示：G-395A与多种老年疾病有遗传关联G-395A位于启动子区G/A替换影响DNA/核蛋白结合为klotho表达调控研究提供新线索为老年疾病防治提供新的思路为老年病治疗提供新的药物靶点假说：G-395A是潜在调控性SNP位点验证假说2. 技术路线：本项目分G-395A功能定位、功能预测和功能证实三部分进行实施，实验路线如下页图所示。 3.创新点与特色： 既往Klotho基因SNP与临床疾病关联研究取得了很大进展，为老年病早期预防提供了多个SNP定位标记，但对可能有调控意义的SNP重视不够，调控性SNP的功

20、能研究有待进一步深入。本项目首次对抗衰老基因Klotho的调控性SNP进行系统的功能分析，鉴定G-395A多态性位点影响的转录因子，并在细胞水平进行验证，有助于明确该位点变异对Klotho基因表达调控的意义，为老年病防治及药物靶点筛选提供理论支持。4.可行性分析：本项目立论依据充分，实验路线明确，所用仪器在西南医院综合实验中心均能满足，所需试剂均有商品化提供，所用到的实验技术本项目组成员均已掌握。前期已有一定前期工作基础，能保证按时完成。本项目的技术路线图：构建系列启动子缺失突变报告基因载体与内参载体共转染HEK293细胞（并在hela细胞中重复实验）测定双报告基因活性，确定核心启动子，为G-

21、395A进行功能定位提取HEK293细胞核蛋白进行EMSA反应加入MZF1、ppar、E2F抗体进行超迁移实验，明确可能影响的转录因子构建一对G/A替换的报告基因载体分别与内参载体共转染293细胞直接比较报告基因活性分别与转录因子表达载体共转染后比较经位点特异性RNA干扰后比较功能定位功能预测功能证实(六)、现有工作基础和条件1）、相关研究工作积累。2）、项目实施所具备的工作条件，包括实验平台和大型仪器设备等。1.相关工作积累项目组已经通过临床病例对照研究在重庆汉族人群中发现G-395A多态性与动脉僵硬度有相关性。为研究其功能，已经构建pGL3-Basic-967kl、pGL3-Basic-4

22、98kl、pGL3-Basic-312kl及pGL3-Basic-137kl4个启动子序列缺失突变的报告基因载体并测序验证（有测序图备索），转染HEK293和Hela细胞的预实验中提示G-395A位点所在序列有启动子活性。下图分别为4个载体的双酶切电泳图及报告基因实验图表。图1：由上至下分别是1kb DNA ladder、pGL3-Basic-967kl、pGL3-Basic-498kl、pGL3-Basic-312kl、pGL3-Basic-137kl和100bp DNA ladder图2：分别为阴性对照、阳性对照及4个载体转染两种细胞的报告基因相对活性。 项目组已经用EMSA法成功检测过N

23、F-b、AP-1、PPAR-等转录因子，如下图所示。显示项目组可以完成EMSA实验。 项目组构建过小鼠FGFR3可控性RNAi载体并转染细胞进行验证，可完成本项目中RNA干扰载体构建及细胞转染工作。2.项目组所具备的工作条件：项目组可依托对全医院开放的西南医院综合实验中心进行全部课题研究，该实验中心的仪器能满足本项目需要。（七）、研究队伍项目负责人和主要学术骨干研究工作简历、主要学术业绩、近五年发表的代表性论文或专著目录（不超过3篇）、获得国家及省部级科技奖励情况（1500字以内）1.项目负责人：徐强：男，38岁，讲师，主治医师，医学硕士，重庆市医学会老年医学专业委员会委员。1995年毕业于华

24、西医科大学。2002年第三军医大学获心血管专业硕士学位。目前在职攻读老年医学专业博士学位。作为负责人已完成第三军医大学中青年基金糖基化终产物促发动脉粥样硬化斑块泡沫细胞形成机制研究（XG200524）,已结题。2005年参与的急性心肌血运障碍机制及多因素干预研究获重庆市科技进步奖三等奖（第四作者）。近年以第一作者发表论著8篇，参编专著两部。代表性论著如下：1 徐强，司良毅，赵晓兰，王璋。大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡Caspase3活性变化规律及药物对其影响。第三军医大学学报，2003，25（15）：13551357 2 徐强，司良毅，赵晓兰，张红，唐维平.Caspase3活性对老年大鼠心肌

25、缺血再灌注损伤影响。实用老年医学， 2004，18（2）：71743 YANG Qi-hong, XU Qiang, ZHANG Hong and SI Liang-yi. Effects of Rosiglizatone on Expression of Acyl-coenzyme A:Cholesterol Acyltransferase-1 Induced by Advanced Glycation End-products in THP-1 macrophages. Journal of Medical Colleges of PLA,2008,23:127-136.2.主要学术骨干：

26、司良毅：男，52岁，教授，主任医师，医学博士，博士生导师。重庆市老年医学专委会主任委员，全军老年医学专委会副主任委员。1983年毕业于中国人民解放军第三军医大学，继续攻读心血管专业，并获硕士及博士学位。1998年任西南医院老年病科主任。是本项目负责人的的博士导师，负责项目进展质控。杨启红：女，34岁，主治医师，医学博士。1998年毕业于同济医科大学，2004年7月于第三军医大学获医学硕士学位。2008年7月于第三军医大学获医学博士学位。熟悉细胞生物学、分子生物学和蛋白技术，擅长EMSA实验，本项目中负责EMSA实验。发表论文中以下文章涉及到本项目的实验技术：1 杨启红，陈林，朱京慈.小鼠胫骨骨

27、折愈合中FGFR3基因表达的原位定位.第三军医大学学报，2005，24（5）：215-218.2 杨启红，徐强，司良毅.糖基化终产物对人单核/巨噬细胞过氧化物酶体增殖物激活受体表达的影响.中华老年心脑血管病杂志，2008,10:214-217.3 杨启红，徐强，张红，司良毅。糖基化终产物对THP-1巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1表达的影响.第三军医大学学报，2008,30:1630-1633.袁侨英：女，31岁，主治医师，医学博士。2007年7月在重庆医科大学获心血管内科博士学位，在读博士研究生期间，先后参与导师黄晶教授承担的国家自然基金重点项目、国家科学自然基金主任基金、重庆市科委

28、攻关课题、重庆市卫生局课题等项目。现在第三军医大学西南医院老年特诊科从事临床及科研工作。博士论文题目：心腔内超声辐照增加基因表达治疗犬心肌梗死。熟悉临床研究及数据分析工作，在本项目中负责数据分析。代表性论文如下：1 YUAN Qiao-ying, HUANG Jing, ZHU Zhengwei, ZHENG Yongping, DENG Chang-ming, LIU Di-chuan, WANG Zhigang, Guo rui. Catheter-based Intramyocardial Injection of Naked DNA Encoding EGFP and Intracar

29、diac Irradiation to Enhance Gene Expression by an Ultrasound Catheter in Dogs ABSTRACT. International Journal of Cardiology. (2006 Impact Factor: 2.234).2008,2: 55-56. 2袁侨英,覃数,司良毅.辛伐他汀对急性心肌梗死大鼠RhoA表达及心室重塑的影响.第三军医大学学报. 2008，12（30）1170-1172.3 袁侨英,黄晶,朱正伟,邓辉胜,李进嵩.导管超声辐照犬心肌组织的生物效应J，重庆大学学报(自然科学版).2007, 30

30、(1):120-122.王虎林：男，31岁，博士研究生。2001年第四军医大学，2005年起在第三军医大学攻读硕士学位，2007年开始提前攻读博士学位。熟悉分子克隆技术，本项目中启动子删减分析。与本项目有关的论文有：1 王虎林,肖航,司良毅.Klotho基因与心血管病的关系及研究现状.中华老年心脑血管病杂志,2007,9(2): 136-138.2 王虎林，孙兰英，司良毅，孟萍，肖航. Klotho基因G-395A多态性与动脉硬化的相关性研究.中华老年心脑血管病杂志,2008,10（2）：96-98.张宜华：男，26岁，博士研究生，2004年7月毕业于第三军医大学，2007年7月第三军医大学大

31、坪医院野战外科研究所硕士学位，2007年9月至今在第三军医大学西南医院老年科攻读博士学位。熟练掌握载体构建、细胞转染等工作,本项目中负责载体构建和细胞转染。与本课题有关的论文有：张宜华,苏楠,杜晓兰,赵玲,陈林.小鼠FGFR3可控性RNAi载体的构建和抑制效率验证.免疫学杂志,2007,23(3): 331334.（八）、申请者承担项目的情况已完成项目项目编号项目名称项目类型负责人起止年限项目经费XG200524糖基化终产物促发动脉粥样硬化斑块泡沫细胞形成机制研究第三军医大学中青年基金徐强2005-20073万在研项目项目编号项目名称项目类型负责人起止年限项目经费无正在申请的项目项目编号项目名称项目类型负责人起止年限项目经费无我保证以上的所填内容完全属实，若有虚假，本人将负全部责任。如果获得资助，我与本项目组成员将严格遵守重庆市自然科学基金计划项目管理办法的有关规定，切实保证研究工作时间，按计划认真开展研究工作，按时报送有关材料，按要求做好结题工作。申请人签字： 年 月 日