荧光发光原理

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1、精品文档，仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除4.1 引言 某些物质被一定波长的光照射时，会在较短时间内发射出波长比入射光长的光，这种光就称为荧光。1852年， Stokes阐明了荧光发射的机制，认为荧光是由于物质吸收了光能而重新发出的波长不同的光，并由一种能发荧光的矿物 萤石(fluospar)而定名为荧光。我们通常所说的荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X射线荧光等。这不是本章要介绍的内容。荧光光谱有两个主要优点：第一是灵敏度高。由于荧光辐射的波长比激发光波长长，因此测量

2、到的荧光频率与入射光的频率不同。另外，由于荧光光谱是发射光谱，可以在与入射光成直角的方向上检测，这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱。第二，荧光光谱可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约10-15秒)，但两个过程中有一个时间延搁，大约为10-9秒，这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竞争。由于荧光有一定的寿命，因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。例如，生色团及其环境的变化过程在紫

3、外吸收的10-15秒的过程中基本上是静止不变的，因此无法用紫外吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。4.2基本概念和原理4.2.1荧光的产生 吸收外来光子后被激发到激发态的分子，可以通过多种途径丢失能量，回到基态，这种过程一般称为弛豫。在很多情况下，分子回到基态时，能量通过热量等形式散失到周围。但是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。*Figure 5.3 Some pathways of relaxation from the excited state.*（P96） 上图（Campbell书中图5.3）表示了激发态分子的几种弛豫过程。由电子态基态被激发到第一电子激发态中各振动能级上

4、的分子，一般会以某种形式(统称为内转换)丢失它们的部分能量，从第一电子激发态的不同振动能级以至从第二电子激发态等更高的电子激发态返回第一电子激发态的最低振动能级。这个过程大约为10-12秒。从第一电子激发态的最低振动能级返回基态的不同振动能级，如果能量以光子形式释放，则放出的光称为荧光。这个过程通常发生在10-6-10-9秒内。由于荧光的频率低于入射光的频率，因此测量到的荧光频率与入射光的频率不同。同时，荧光是从与入射光成直角的方向上检测，这样荧光不受来自激发光的本底干扰，可以达到很高的灵敏度，一般比吸收光谱高两个数量级左右。此外，由于荧光有一定的寿命，且其寿命比紫外吸收的时间过程(10-15

5、秒)要长，因此一些用紫外观测不到的变化过程(如生色团及其环境的变化)，恰好可以用荧光来观测。在紫外吸收的时间过程(10-15秒)中，生色团及其环境基本上是静止不变的。而在很多反应中，溶剂的重新排列和分子的运动过程发生的时间与激发态的寿命是同一量级。4.2.2 磷光如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。*Figure 5.3 Some pathways of relaxation from the excited state.*（P96）磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的

6、分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。处于第一电子激发态最低振动能级的分子，有可能通过无辐射跃迁(系间交连，intersystem crossing)消耗部分能量，其中一个电子的自旋方向倒转，从而处于三线态。从三线态的最低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光子，则其发光为磷光。由于三线态的电子自旋和不为零，这种跃迁是一种被禁跃迁，即跃迁几率很小。这

7、样，在三线态停留的时间即寿命就比较长(从10-3秒到数秒)，强度很弱。由于三线态能量低于第一电子激发态最低振动能级，因此磷光的波长比荧光长。4.2.3 激发谱和发射谱 (参考书P94)荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。激发谱既然是表示某种荧光物质在不同波长的激发光作用下所测得的同一波长下荧光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有关，因此激发谱和吸收谱极为相似，呈正相关。由于激发态和基

8、态有相似的振动能级分布，而且从基态的最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系。Processes leading to fluorescence *Figure 5.2*(p94)在发射谱中最大荧光强度的位置称为lmax，它是荧光光谱的一个重要参数，对环境的极性和荧光团的运动很敏感。4.2.4 荧光寿命(fluorescence lifetime) 参考书p95去掉激发光后，分子的荧光强度降到激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间，称为荧光寿命，常用t表示: I t=I 0e-kt 其中I

9、 0是激发时最大荧光强度，I t是时间t时的荧光强度，k是衰减常数。假定在时t时测得的I t为I 0的1/e，则t是我们定义的荧光寿命。kt=1t=1/k即寿命t是衰减常数k的倒数。事实上，在瞬间激发后的某个时间，荧光强度达到最大值，然后荧光强度将按指数规律下降。从最大荧光强度值后任一强度值下降到其1/e所需的时间都应等于t。如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射的速率常数成反比，速率常数即为单位时间中发射的光子数，因此有tF=1/KF。KF是速率常 数。tF表示荧光分子的固有荧光寿命，kF表示荧光发射过程的衰减常数。如果除荧光发射外还有其它释放能量的过程(如淬灭和能量

10、转移)，则寿命t还和这些过程的速率常数有关，结果是荧光寿命降低。由于吸收几率与发射几率有关， tF与摩尔消光系数emax (单位为cm2mol-1或(mol dm-3) -1cm-1)也就密切相关，从下式可以得到tF的粗略估计值(单位为秒)。1/tF104emax在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。4.2.5 量子产率 (quantum yield) 参考书P96荧光量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的本领。荧光量子产率通常用f来表

11、示，定义为发射量子数和吸收量子数之比，即由荧光发射造成的退激分子在全部退激分子中所占的比例，又称为荧光效率，即发射量子数吸收量子数处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程回到基态。其结果是加快了激发态分子回到基态的过程(或称退激过程)。总的退激过程的速率常数k可以用各种退激过程的速率常数之和来表示:k=kF+kiki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。则总的寿命t为:t=1/k=1/(kF+ ki)因此，量子产率又可以表示为因为 1/kF=tF ， t=1/(kF+ki)所以 f =t/tFf的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知道仪器的修正因子。实际测量中

12、大多采用相对法，即用已知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。后面将要证明:对稀溶液来说，荧光强度F与吸收度A成正比:F=kI0Aj这里k是比例常数，I0是吸收前的光强度， f 是荧光量子产率。若两种溶液测量条件完全相同，则:F1/F2=A1f 1/(A2f 2)f 1/f 2=F1A2/(F2A1)已知f 2就可求出f 1。由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小的现象称为淬灭(quenching)，如温度淬灭，杂质淬灭等。量子产率对于生色团周围的环境以及各种淬灭过程很敏感。量子产率的改变必然会引起荧光强度的改变。因此，如果只要研究量子产率的相对值，只要量测荧光强度也就足够了。4.2.6 荧光

13、强度：参考书P97荧光强度F取决于激发态的初始分布IA与量子产率f的乘积。这里的F指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和，实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。因此仪器测到的荧光强度=IAf Z，这里Z是仪器因子。椐据Beer-Lambert定律IA=I0-It=I01-exp-2.3e (lA)Cl式中e (lA)为激发波长处的消光系数，为样品分子的浓度，I0为入射光强度，I0为透过样品后的光强度，l为光程（样品池光径）对于稀溶液，吸收很稀， e (lA)很小-2.3e (lA)Cl1因此，1-2.3e (lA)Clexp(-2.3e (lA)Cl)IA=I0(1-(1-2.3e (lA)C

14、l) =2.3I0e (lA)ClF=IAfZ=2.3I0e (lA)CljZ如果激发光强保持不变，且j和Z与激发波长无关，则Fe (lA)很显然，荧光强度与样品在波度lA处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。激发谱与吸收谱的正相关关系在此一目了然。当然，实际上仪器因子Z与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。4.2.7. 荧光偏振（偏振荧光，极化荧光） 参考书P98用平面极化光（偏振光）去激发一个荧光系统，可以产生极化荧光。可以通过对极化荧荧光的分析确定分子的大小，形状和流动性等性质。因此极化荧光分

15、析在生物研究中是一种有力的手段。Figure T-format for polarization measurements. DET, detector; G, gain. Subscripts refer to horizontal (H), vertical (V), perpendicular() and parallel(/).图 荧光偏振测量如图所示，假设沿z轴振动的平面极化光由x轴入射原点，在原点有荧光分子，受其激发后此分子发射极化荧光，在y轴收集极化荧光，令I为沿轴振动的极化荧光，令I为沿轴振动的极化荧光。定义极化率P=(I-I)/(I+I) =(IVV-IVH)/(IVV+IV

16、H)下标中的前，后两个字母分别表示入射光和发射光的偏振方向，V(vertical)表示垂直，H(horizontal)表示水平，如其中IVH是指入射光偏振方向为垂直而发射光为水平时测得的荧光强度，其它如IVV也依此类推。荧光偏振是指物质在受激发时发射的荧光常为偏振光这样一种性质。从经典物理的观点来看，电子的跃迁相应于一个电偶极子的振动，其振动方向和电场变化方向一致时被激发发的几率最大，并随两者间夹角余弦的平方（COS2q）而变化。电偶极子发射的荧光在与电偶极子方向垂直的方向上最强（即荧光传播方向与电偶极子方向垂直的荧光最强），在与电偶极子平行的方向上最弱。溶液中的分子，其分布是随机的，而且从吸

17、收到发射的时间之内，分子本身已经产生了转动，因此荧光偏振的程度将减小，所以荧光偏振又常称为荧光消偏振或荧光去偏振。在分子朝向无规律但分子不能自由运动的溶液中，的值称为本征极化率P0。如果分子在激发态的寿命期间有一定的运动，则的值可能与P0不等。定义不对称度(或荧光各向异性) A=(I-I)/(I+2I)(I+2I)表示发射光的全部，包括平行于入射光方向上的以及与入射光轴垂直的两个方向上的分量。由于单色器和光电倍增管等对垂直和水平两个偏振成分的敏感度可能不同，因而严格的测定需要引入校正因子G，G为水平偏振光激发样品时，仪器对垂直偏振光的透射效率与对水平偏振光透射效率之比，定义为G=IHV/IHH

18、，IHV为起偏器水平取向而检偏器垂直取向时测得的荧光强度，IHH为起偏器和检偏器均为水平取向时测得的荧光强度。仪器不同，波长不同，值都可能不同，应分别测定。经校正后的荧光偏振度=(IVV-GIVH)/(IVV+GIVH)经校正后的不对称度A=(IVV-GIVH)/(IVV+2GIVH)P和A的量测有时在稳态条件下进行，即采用恒定的光照。但有时也用毫微秒量级的偏振光脉冲来测量I和I的时间函数。这种技术常能测到一些其他的运动，是一种时间分辨的技术。4.2.8 天然荧光生色团和荧光探针(Natural fluorophores and fluorescent probes)参考书P99102生物化学

19、中主要的荧光生色团可分为天然荧光生色团和荧光指示剂（荧光探针）两类。天然的荧光生物分子只有芳香族氨基酸、核黄素、维生素A、叶绿素和NADH等少数分子，核酸中的碱基没有显著的荧光，只有tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）是个例外。在蛋白质的荧光谱中，由色氨酸残基发出的荧光占统治地位。Table 5.1AbsorptionFluorescenceSensitivityFluorophoreConditionslmax(nm)emax(10-3)lmax(nm)fFtF(ns)emaxfF(10-2)TrpH2O pH 72805.63480.202.611.TyrH2O pH 72741.4303O.

20、13.61.4PheH20 pH 72570.22820.046.40.08Y-baseYeast t-RNAPhe3201.34600.076.30.91总的来说，天然的荧光生物分子种类很有限，而且荧光强度较弱，为了研究多数的不发光的生物分子，人们广泛利用一类能产生稳定荧光的分子，把这些小分子和大分子结合起来，或者插入大分子中，根据这些较小的荧光分子性质的改变，分析大分子的结构，这类小分子称为荧光探针。对于作为荧光探针的分子有以下几个基本要求：（1）能产生稳定的，较强的荧光。（2）探针与被研究分子的某一微区必须有特异性的结合，而且结合得比较牢固。（3）探针的荧光必须对环境条件较敏感。（4）结

21、合的探针不应影响被研究的大分子的结构和特性。荧光探针种类很多。而且不断有人根据需要合成出新的探针。Campbell书图5.5列出了几种常用荧光探针的结构，书表5.2列举了一些典型的荧光探针的应用和基本性质（吸收波长，发射波长，灵敏度等）。参考书图5.5Table 5.2 Typical fluorescent probesaAbsorptionEmissionbSensitivityProbeUseslmax(nm)emax(10-3)lmax(nm)fFtF(ns)fFemax(10-2)Dansyl chlorideCovalent attachment to protein: Lys,

22、Cys3303.45100.1133.41,5-I-AEDANS3606.84800.515347-Chloro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole(NBD)Lys, Tyr3459.5-1Fluorescein isothiocyanate(FITC)Covalent attachment to protein: Lys495425160.341168-Anilino-1-naphthalene sulfortate(ANS)Noncovalent binding to proteins3746.84540.981667Pyrene and various deri

23、vativesPolarization studies in membranes342403830.25100100Ethenoadenosine and various derivativesAnalogues of nucleotides bind to proteins. Incorporate into nucleic acids3002.64100.402610Ethidium bromideNoncovalent binding to nucleic acids5153.8600126.538Proflavine monosemicarbazideCovalent attachme

24、nt to RNA 3-ends445155160.02-30参考书表5.24.3 环境对荧光参数的影响荧光分析的主要特点是灵敏度高。一般来说，荧光分析的灵敏度要比吸收光谱测量高2-3个数量级。但正因为其灵敏度高，因此也容易受到各种因素的干扰。例如样品的温度度，pH值以及样品中杂质的存在等等。为了得到可靠的结果，实验设计和操作中需要考虑和设法减少这此因素的影响。在一定的场合，也可巧妙地利用荧光参数对环境困素的敏感性来达到我们的目的。下面，我们将分别列举一些环境因素对lmax、j F和tF等荧光参数的影响。4.3.1 环境因素对lmax的影响 参考书P102一般来说，处于第一电子激发态的分子，其

25、电荷分布与它处于基态时是不同的。生色团与周围溶剂分子的相互作用可能会先于发射而发生，这种相互作用会改变激发态的能量及荧光发射的频率。引起每个电子能级中最低振动能级之间的吸收和发射跃迁（即0-0跃迁）的不平衡，并会破坏镜象关系。4.3.1.1环境(如溶剂)的极性对lmax的影响同一种荧光物质在不同极性的环境中，其lmax 可能会有所差别。一般来说，激发态的极性比基态要强，因此被激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂（或极性环境）相互作用，使溶剂分子的电子分布会发生变化，偶极子重新取向，而这又会反过来影响荧光分子的基态和激发态能级，减少激发态的能量，引起发射谱的红移。例如(见Campbell书p103）

26、，当溶剂的极性由乙二醇、甲醇、异丙醇到辛醇依次减小时，ANS（1-氨基-8-萘磺酸酯，一种荧光探针，常用于与蛋白质非共价结合）的荧光谱发生兰移，量子产率提高。Figure 5.6 The fluorescent spectra of l-anilino-8-naphthalene sulfonate (ANS) shifts toward the blue, and the quantum yield increases as the solvent polarity decreases in the order: ethylene glycol, methanol, n-propanol,

27、and n-octanol 这种影响的结果可以用Lippert方程来解释：常数其中，sa与sf分别为荧光分子的吸收波数与发射波数，sa-sf 反映了吸收光与发射光能量的差别；e为溶剂的介电常数；h为普朗克常数；c为光速，a为荧光分子在溶剂中所占空穴的半径，m*与m分别为荧光分子处于基态和激发态时的偶极矩。由上式可见，折射率增加使能量差减少，而介电常数增加会使能量差增大。由于荧光分子激发态的偶极矩m*一般要大于基态偶极矩m，荧光分子偶极矩的增大与溶剂分子相互作用，使溶剂分子的电子分布和偶极子取向发生变化。溶剂偶极子的重新取向需要比电子重新分布长得多的时间。介电常数e不仅与偶极子取向有关，也与电子

28、取向有关，上式中第一项(e-1)/(2e-1)是电子和偶极子重新取向的结果；折射率n与电子重新分布有关，因此上式中第二项是电子重新分布的结果。由于非极性溶剂分子没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分子的作用下偶极子重新取向的问题，en2， sa-sf很小。而在极性溶剂中sa-sf 较大，产生红移。(参考书P103例5.6)ANS在水中lmax 为515nm，与脱辅基肌红蛋白结合以后，lmax 移到454nm。ANS的lmax 兰移告诉我们，ANS与脱辅基肌红蛋白的结合部位可能在一个极性较小的疏水环境中。实验事实还表明：ANS与脱辅基肌红蛋白的结合可以被血红素置换。这提示：ANS的结合是发生在血红素

29、口袋（heme pocket）中或是其附近。这样可以进一步推测：血红素口袋附近也是（极性较小的）疏水环境。上面提到的“环境极性加强，lmax红移”的规律，并不是绝对的。例如，如果在激发态的寿命之内，分子没有足够的时间来重新排列并降低激发态的能量，则可能发生lmax兰移的情况。这种现象称为“orientation constraint”(参考书P103)。这说明在利用lmax作为环境极性的探针时要十分谨慎。4.3.1.2 pH值对lmax的影响：如果荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对lmax有影响。这是因为弱酸和弱碱分子和其离子在电子结构上有所不同，因而荧光lmax也可能发生变化。例如

30、，1-萘胺-5-磺酸在不同pH值时，会以两种不同离子的形式存在，这两种离子的荧光波长是不同的。利用这种效应，可以将其荧光波长作为pH值的指示剂。4.3.1.3 溶液粘度对lmax的影响溶液粘度有时也会对lmax有影响，例如TNS在蔗糖水溶液中的lmax会随蔗糖浓度的变化而变化。当蔗糖浓度由10%增加到60%，粘度从1.3分泊增加到58分泊，lmax以580nm兰移到555nm。4.3.1.4共振能量转移对lmax的影响(参考书P113114)如果两种生色团荧光频率接近，则当两种基团足够接近时，用一种生色团能吸收的光激发使之处于激发态后，处于激发态的这种生色团可能将激发能转移到另一种生色团，使第

31、二种生色团进入激发态，产生第二种生色团特有的荧光，这种现象称为共振能量转移。显然，共振能量转移对lmax可能造成影响。4.3.2 环境对荧光量子产率fF和荧光强度的影响(参考书P103106) 由于稀溶液中荧光强度Fl=KI0Af F ，（这里I0是激发光强度，A是光密度或吸收度，f 0是荧光量子产率，K为常数）因此凡是会影响荧光量子产率fF的环境因素也必然会影响荧光强度。4.3.2.1溶剂（或环境）极性的影响量子产率（荧光强度）会随着溶剂（或环境）极性的减小而增加。这一点前面已经提到过。一种可能的机制是：在非极性的溶剂中系间交连（转移到另外的激发态）的速率会减少。4.3.2.2光化分解荧光物

32、质因吸收光能而造成某一键断裂的现象称为光化分解（photodissociation），光化分解会造成荧光逐渐减弱。尤其是对于稀溶液来说，光化分解就更为严重。通常，为减少光化分解现象造成的影响，可采取以下措施：I. 减少光照时间和强度：例如，保存在深色瓶中，或用黑纸、铝箔等好，测量时使用较弱的光源等。如果样品激发谱有一个以上的激发峰，一般采用激发波长最长的激发光，以减少样品的光化分解。样品放到样品架上后要尽快测量，不测时应立即关上光闸。II. 由于稀溶液更容易变质，而样品在浓溶液中要稳定一些，因此储备液要配得浓一些，使用前再稀释。III. 仪器本身的改进如提高检测器灵敏度，降低光源强度等，也有利

33、于减少光化分解。4.3.2.3 温度对荧光强度的影响一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强，温度的升向与荧光强度的减弱在一定范围内是线性关系。温度每升高1C，荧光减弱的百分数称为温度系数。一般荧光物质的温度系数大约为1%，但有些荧光物质可大到5%。温度升高，荧光强度减弱的原因主要是溶液的粘度减小，溶剂与溶质分子的动能增加，使得荧光分子的其它分子之间的碰撞几率增加，激发态荧光分子通过分子间碰撞或分子内能量的转移，将自己的能量转移出去。以非荧光发射的形式回到基态，这就造成荧光淬灭，量子产率降低的情况。如果溶液中有淬灭剂存在，则淬灭剂的作用也会随温度升高而增大。 为减少温度对荧光强度的影响，可采

34、用恒温样品架维持样品温度的恒定。4.3.2.4 样品浓度对荧光强度的影响：在样品浓度较低时，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。但到了一定浓度以后，就不再存在这种正比关系。这是因为：I. 荧光强度F=KfeI0(1-e-elc)，这里K是仪器常数，f是量子产率，I0是激发光强度，e是克分子消光系数，l是样品池光径，C是样品浓度。浓度增加到一定程度后，接近0，浓度继续增加，荧光强度不再增加。只有样品浓度很稀时，F=KI0f 1-(1-elc)=KI0felCII. 荧光浓度过大时，常常发生淬灭现象。这样就使荧光强度反而大大低于接近饱和时的荧光强度。淬灭产生的原因至今仍众说纷纭，最简单的解释是：单线能

35、级的激发分子在发出荧光之前就和未激发的荧光物质分子碰撞而自淬灭。III. 浓度过高，可能形成样品分的二聚体或多聚体。因而降低荧光强度。IV. 产生浓度淬灭的重要原因之一是荧光分子在样品池中分布均匀：当溶液较稀时，均匀分布在样品池中的荧光收强烈，越进入溶液，发荧光分子越少，因而大量的激发光在到达池内之前就被吸收了。这样，从垂直于激发光方向的角度来接收荧光，检测到的荧光就很微弱了。即使是在靠近入射光的面上，也只有靠近检测器的面上荧光容易被接收到。离探测器较远的荧光分发出的荧光又会被瓣面的荧光分子吸收（如果物质本身的吸收光谱和发射光谱有重叠的话），即大部分荧光发射在离开吸收池前就又被吸收。解决浓度淬

36、灭的办法之一，是将样品尽量稀释到荧光强度与荧光染料宵度成范围线性关系的深浓度来测量。浓度淬灭的现象有时也可以加以利用，例如在脂质体里包裹高浓度的荧光染料，由于浓度淬灭，包裹在脂质体内的荧光染料荧光强度很低。一旦荧光染料从脂质体内泄漏出来，由于荧光染料浓度下降，进入线性区，因此荧光强度大大增加。4.3.2.5杂质对量子产率（荧光强度）的影响除荧光分子之外的其它分子与荧光分子的相互作用使荧光量子产率减少的现象统称为杂质淬灭。会引起荧光淬来的物质称为淬灭剂。例如中性的0.1M磷酸缓冲液能淬灭酪氨酸的荧光。杂质淬灭的形式大致有以下几种：. 碰撞淬灭：溶液中荧光分子与淬灭剂分子碰撞，荧光分子损失能量而导

37、致量子产率减少，荧光强度降低。. 组成化合物导致荧光淬灭：一部分荧光分子与淬灭剂分子作用而形成络合物。这种络合物本身可能不发荧光，也可能会具有吸收激发光能或荧光物质所发射的荧光光能的能力，从而减少观察到的荧光（内滤光效应）。. 含溴、含碘化合物、硝基化合物、重氮化合物、 基化合物、 基化合物及某些杂 化合物容易由单线态转变至三线态。转入三线态的分子在常温下不发光，它们把多余的能量消耗在与其它分子的碰撞中，引起荧光淬灭。只有在低温下，由三线态返回基态而放出波长的磷光。. 发生电子转移反应的淬灭。 某些淬灭剂分子与荧光物质分子相互作用时，发生了电子能移反应，即氧化-还原反应。因而引起荧光淬灭。甲基

38、兰荧光溶液被Fe+2淬灭便是一个例子。发生电子转移反应的淬灭剂并不限于金属离子。I-、Br- 、CNs-等易于给出电子的阴离子对奎宁，罗丹明及荧光素钠等有机荧不物质也会发生淬灭作用。. 共振能量转移：（略）引起淬灭的一种最常见的物质是大气氧。氧分子对荧光物质产生淬灭的原因可能主要是由于O2在基态就是一种三线态，它在和单线态的荧光分子相互作用时会形成单线态的氧分子和三线态的荧光分子。氧在弱极性溶剂中的溶解度比较高，例如氧在乙烷中的溶解度约为在水中的几倍。因此必须通氮赶氧，克服这种淬灭。总的来说，为克服杂质淬灭带来的问题，对所使用的溶剂或缓冲液，首先要考虑其对所使用的荧光物质是否有直接作用。另外必

39、须考虑溶剂的纯度。此外如洗液中的重铬酸钾，其两个吸收峰恰好在色氨酸的激发和发射峰附近。吸收了色氨酸的激发能及其发射的荧光（内滤光效应）因此荧光器皿不能用洗液来洗。荧光淬灭剂有时也可以加以利用，例如可以利用某种淬灭剂对荧光物质的淬灭作用来进行定量分析。例如，利用氧分子对硼酸根一二 乙醇酮络合物的荧光淬灭效应，可以作微量氧的测定。由于淬灭作用是特异性的，因此用这种方法有时比直接测定法灵敏度更高，选择性更强。4.3.2.6 pH值对量子产率和荧光强度的影响 如荧光物质为弱酸或弱碱，则溶液pH值的改变常对荧光强度有较大影响。利用这些物质对pH值的敏感性，可以将它们用作pH指示剂，或利用它们在不同pH值

40、溶液中荧光强度的改变来判断酸碱滴定的络点（特别是在有色或混浊的溶液中）。4.3.2.7溶液粘度对荧光强度的影响荧光强度一般随介质粘度的升高而增强。因为介质粘度增加，减少了分子碰撞，从而减少了能量损失。例如荧光物质NTS在不同浓度的蔗糖水溶液中，荧光强度随粘度增加而增加。（郭书p111图5.6）4.3.2.8膜电位的影响有些能和膜结合的荧光分子的荧光强度会随着膜电位的改变而改变，这种变化有的是由于带电的荧光染料随膜电位变化而在膜内外重新分布。有的是由于荧光分子的荧光谱在电场下发生改变（电生色性， electro chronism）。按照对膜电位变化的反应速度，大小和光学信号改变的机制，这类电位敏

41、感的荧光染料又可以分为慢反应染料和快反应染料。这种现象可以用来监测膜电位的变化。4.3.2.9其它各种干扰因素还有一些其它的干扰因素可能影响荧光强度，例如光散射就可能影响荧光强度。区分散射光和荧光发射的依据，是散射光与激发光波长相同，离荧光峰较远。荧光污染也是影响荧光强度的一种因素。例如洗涤器皿的合成去污剂常能产生很强的荧光，分液偏斗上涂的润滑油也有很强的荧光。另外，溶液中微生物的产生，滤纸中的杂质，也都有可能造成荧光污染。另外，表面吸咐也会对稀溶液的荧光测定造成影。4.3.3 环境因素对荧光寿命的影响4.3.3.1碰撞淬灭前面曾提到碰撞淬灭会降低荧光强度，碰撞淬灭也可能使荧光寿命缩短。例如前

42、面提到的0.1M磷酸缓冲液，能使酪氨酸的荧光寿命从3.4ns缩短到2.6ns。4.3.3.2浓度与荧光寿命的关系一些荧光染料的荧光寿命随浓度的增加而延长。这种现象不是由于二聚体的形成，而是由于自吸收。特别是当吸收光谱与荧光光谱有较大重叠时，重叠区的荧光发射后，再一次被吸收，经历了二次激发或多次激发，测量到的表观寿命就会延长。4.3.3.3 分子内环境与荧光寿命生色团在分子内的环境也会影响荧光寿命，正是由于这个原因，荧光寿命才被用来分析分子内不同的生色团所处的环境。当然，严格地说，分子内环境和外环境是两个不同的概念。除上述可能影响荧光寿命的因素之外，实际中要注意的是，不同测量方法测出的寿命也会有

43、一定差别。因此研究荧光寿命时，相同方法测量出来的寿命才有可比性。4.3.4 环境对荧光偏振度的影响4.3.4.1温度对荧光偏振度P的影响（1）温度对荧光偏振度P的影响：一般来说，温度升高，荧光偏振度会下降。4.3.4.2 粘度对荧光偏振度的影响随着粘度的提高，荧光偏振度也会上升。4.4 仪器原理及结构： 荧光谱仪结构上的最主要特点是入射的激发光与荧光探测方向垂直。如图 所示。 图 是M850型荧光光谱仪的结构框图。仪器主要组成部分如下：1. 光源：此处光源为氙灯，氙灯在200-800nm范围内具较好的发射谱。汞灯是为校准用的。2. 入射光单色器：入射光单色器是用来选择特定波长的单色光，入射到样

44、品上。荧光分光度计中采用光栅作为单色器。激发波长择描就是靠它来改变波长。3. 监视探测器：这个探测器用来监测光源的恒定性。4. 光闸：光闸关闭时，入射光被挡住，不能照到样品上，这样可以防止样品长期受到照射而产生化分解。另外，在打开样品室的盖时，关上光闸，可以防止读数过大，给图笔撞击端部。5. 样品杯：样品杯是10mm10mm的石英杯，四面透明，且用去荧光石英材料制成。注意荧光样品杯不能用紫外谱仪中的样品杯代替。6. 发射光单色器：用来选择一定波长的光进入探测器测量。发射光择描就是用它来实现的。7. 计算机辅助记录系统：用以完成绘图及荧光强度的测量。图 M850型荧光光谱仪结构示意框图。B. I

45、nstrument Configurations for Conventional Fluorescence Measurements Instruments designed for luminescence spectroscopy can usually be used for either fluorescence or phosphorescence measurements with a few instrumental modifications generally required for the latter. In this section we will discuss

46、the instrumental configurations used for fluorescence instruments. Subsequent sections will address the specific instrumental requirements and some of the special techniques required for phosphorescence measurements.Figure 7. Schematic diagram of a double-beam (ratiometric) filter fluorometer. From

47、Sequoia-Turner, with permission.Figure 8. Schematic diagram of a single-beam spectrofluorometer. From Perkin-Elmer, with permission.1. Filter Fluorometers.Instruments in which wavelength selection is accomplished with filters are generally referred to as fluorometers, whereas monochromator-based ins

48、truments capable of spectral scanning are called spectrofluorometers. The simplest, least expensive, fluorometers are single beam filter instruments with halogen lamp sources, phototube or PMT detectors and simple output devices. Ratiometric fluorometers are also available in which the ratio of the

49、sample signal to a reference signal is used in order to compensate for fluctuations in fine voltage, drift, etc. In some instruments, such as the one shown in Figure 7, the sample and reference light paths are taken from the same source and alternately measured by the same detector through the use o

50、f a mechanical cam. A similar configuration in which two detectors are used, one for the sample beam and one for the reference beam, will correct for source output fluctuations only. Single detector configurations are also possible to minimize effects of detector variability. Filter fluorometers are

51、 suitable for quantitative analysis applications in which spectral scanning and high resolution are not required. Filters transmit more light and cost less than monochromators, thereby providing better detection limits with less expensive instrumentation.2. Spectrofluorometers.Figure 9. Schematic di

52、agram of a ratiometric spectrofluorometcr. From PerkinElmer, with permission. Spectrofluorometers are also available in both single beam and ratiometric configurations. A single beam instrument is shown in Figure 8. A ratiometric spectrofluorometcr configuration in which two separate detectors are e

53、mployed is depicted in Figure 9. The reference PMT monitors the excitation beam after it has passed through the monochromator so that corrections are based on fluctuations in thc wavelength of interest only. The reference PMT is placed after the sample to monitor the transmitted beam, thereby allowi

54、ng absorption measurements to be made on the sample.Figure 10. Depiction of single photon counting. The signal is detected by the PMT, emerging as a pulse which is then amplified. If the magnitude of the amplified pulse exceeds a certain threshold, it is passed through the discriminator and counted

55、as a signal. Smaller pulses due to noise and dark current are much more likely to be rejected, thereby increasing signal-to-noise. From J.D. Ingle, Jr. and S.R. Crouch, Eds., Spectrochemical Analysis, Prentice Hall, (1988), with permission. Single photon counting instruments are used to measure very

56、 low light levels and are designed for maximum signal-to-noise performance. Figure 10 illustrates the single-photon counting detection scheme. Double monochromator arrangements are often used in the excitation or emission beams of single photon counting instruments to minimize stray light. Cooled PM

57、T housings may be useful to minimize detector noise. Effects of fluctuations in source output can be minimized by ratiometric detection, in which a reference PMT detects a portion of the excitation beam that is diverted to the detector by a beam sputter placed between the excitation monochromator an

58、d the sample. If an appropriate blank solution is placed in the reference beam, absorption measurements can also be made. Spectrofluorometers offer the most flexibility for quantitative and qualitative applications. Many instruments are modular so that monochromators can be replaced with filters in

59、the emission or excitation beams if desired.4.5荧光分析在生物学中的应用荧光分析应用的范围很广。生物学和医学的各个学科，包括生理、生化、生物物理、药理、免疫、细胞、遗传等，都可以使用这一技术。从研究的材料来看、氨基酸、蛋白质核酸、维生素酶、药物、毒物等都可以采用。我们不准备系统介绍荧光技术在各方面的应用，只想就内源荧光和外源荧光在生物学、医学中应用的可能性，举一些例子。4.5.1内源荧光的探测和应用生物学中比较重要的天然荧光分子多属具有共轮双键的系统。如芳香氨基酸、核黄素、维生素A、卟啉、叶绿素、NADH和tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）等。对于含

60、有这些天然荧光物质的样品，可以直接通达量测其荧光来确定其存在，分布及数量。4.5.1.1蛋白质的内源荧光利用蛋白质的内源荧光蛋白，其灵敏度高于紫外吸收法，而且没有可检测的荧光。蛋白质的荧光来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸。它们的相对荧光强度为100:9:0.5。检测蛋白质的天然荧光，可采用280nm的激发波长，发射波长范围在340-350（蛋白溶液为中性时）。如果蛋白中不含色氨酸，只含苯丙氨酸和酪氨酸，则荧光光谱主要表现酪氨酸的特征，最大发射波长约为304nm。对于含有色氨酸的蛋白，荧光光谱则主要表现色氨酸的特征，最大荧光发射在320-350nm之间。利用蛋白质的天然荧光，可以检测蛋白质的含量。例

61、如用荧光检测牛奶中的蛋白质含量，就是一种既快又准确的方法。利用蛋白质的内源荧光，还可以分析蛋白质结构的变化。4.1.2维生素的内源荧光分析：由于维生素大多会有芳香环结构，本身具有较强的天然荧光，因此可以利用内源荧光检测维生素。例如，可用345nm激发，490nm处测量，用以确定血液中维生素A的含量。核黄素即维生素B2在pH7.0时，用激发波长370nm（或440nm），发射波长为565nm检测，可以确定组织中核黄素的总量。维生素B12在pH7的溶液中，可以用275nm激发，305nm处检测。维生素C用490nm激发，可产生绿色荧光（530nm）。4.2 外源荧光的应用：由于天然荧光分子种类有限

62、，在生物学和医学的实际中，应用得更加广泛的是荧光探针，即外源荧光技术。目前，荧光探针的种类已经有上千种，人们可以根据所研究问题的不同，选择不同的荧光探针。下面我们将介绍几个荧光探针应用的例子。4.2.1蛋白质的荧光标记：有些荧光探针可以与蛋白质上特定的基团共价结合，例如胺基(amine)和巯基(thiol)就是蛋白质中容易结合的两种基团。例如：卤代乙酰类衍生物(haloacetyl derivatives)顺丁烯二酰亚胺(maleimides)及其它一些巯基反应剂，可以和巯基共价结合；异硫氰酸盐(isothiocyanates)，琥伯酰亚胺酯(succinimidyl esters)，羧酸(c

63、arboxylic acid)，磺酰氯(sulfonyl chloride)等，可以和氨基共价结合；等等。另外有一些荧光探针可以和蛋白质非共价结合。例如：1，8-ANS和2，6-TNS， DNS等，在水中基本不发荧光，但当结合到一些蛋白质上时，可以发出很强的荧光。利用蛋白质的荧光标记方法，可以研究荧光探针标记的部位微环境的极性、结构、分子运动、结合紧密程度等。也可以利用共振能量转移原理测定基团之间的距离等。4.2.1.1 利用荧光探针研究蛋白结合部位的极性：前面曾提到过ANS荧光谱会随着所处环境特性的增加而发生兰移(参考书P103)，且量子产率也随之提高。利用ANS的这个性质，可以衡量ANS标记部位的极性大小。根据极性大小，又可以进一步推测蛋白质结构的变化。4.2.1.2利用荧光探针研究蛋白质结构的变化：由于荧光探针的荧光谱对环境变化十分敏感，因此它对蛋白质分子的构象变化也就十分敏感。利用荧光探针研究了许多酶的变化效应。例如用DNS-Cl标记DNS-GDH（GDH 谷氨酸脱氢酶）在有辅酶存在时的荧光光谱与没有辅酶时相比，有明显变化，