消化道酶活力

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1、第四章 牛蛙主要消化酶的分布及pH和温度对消化酶活力的影响牛蛙(Rana catesbeinana )隶属两栖纲无尾目蛙科，其肉质细嫩，味道鲜美， 营养丰富，是有名的肉用型蛙类。牛蛙具繁殖快、适应性强、生长迅速和抗 逆性强等优点，且其养殖饲料易取。在我国，牛蛙的人工养殖得到了大规模 推广1。研究消化酶的活力及其影响因素可了解动物对食物不同成分的消化 能力，为动物天然饲料的选择、优质人工饲料的配制和适宜养殖条件的确 立提供理论基础，对提高动物养殖的经济效益无疑是有帮助的。目前，对 低等脊椎动物消化酶的研究主要集中在经济养殖型鱼类2-9和爬行类10，对 两栖类消化酶的研究报道较少11-14。奚刚等

2、14对牛蛙幼体发育阶段消化道 蛋白酶和淀粉酶的活力变化情况进行了研究。有关成体牛蛙消化系统消化 酶分布情况及各种理化因子对牛蛙消化酶活力的影响方面的研究尚未见 报道。pH和温度是影响牛蛙生活的重要环境因子，其可通过影响消化酶活 力直接影响牛蛙对食物的消化吸收能力，并最终影响牛蛙的生长发育。本 文在检测牛蛙消化系统蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶分布情况的基 础上，对pH和温度对牛蛙消化酶活力的影响进行了研究，旨在增进对牛蛙 消化生理特点的认识，为牛蛙人工养殖中环境因子的控制和饲料营养成分 的合理搭配提供理论依据。1 材料与方法1.1 实验材料鲜活的成体牛蛙购自芜湖市黄山西路菜市场，重25030

3、0 go将牛蛙毁 髓处死，剖腹，迅速取出胰脏和完整消化道。将消化道剪开，用4C预冷 的 0.65 %的生理盐水快速洗净，按食道、胃、前肠、中肠和后肠(直肠)取 材，用吸水纸轻轻吸干，称重。1.2 酶液的制备根据所称得的消化系统各部分的质量，加入20倍质量的4 C蒸馏水，在冰水浴中充分匀浆，捣成糜状，以 2000 r/min 的速度冷冻离心 15 min， 取上清液即为酶液。保存于4C冰箱中，8 h内分析完毕。1.3 消化酶活力的测定1.3.1 蛋白酶活力的测定 采用福林-酚试剂法11，略有改动。取 0.5 mL 1 % 的酪蛋白溶液于试管中，分别加入不同pH值的缓冲液2 mL,混匀，30 C

4、水浴预热5 min。在反应管中按食道、胃、前肠、中肠、后肠和胰脏顺序 分别加入 0.25 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.5 mL、0.5 mL 和 0.5 mL 预热的粗酶 液。恒温水浴锅控制反应温度，充分反应15 min。立即加入1.5 mL 10 %的 三氯乙酸终止反应，静置15 min。对照管在加入10 %三氯乙酸后再加酶液。 过滤，取滤液1 mL,力口 0.55 mol/L的Na CO 5 mL,福林-酚试齐卩1 mL,23摇匀。在30 C水浴中显色15 min。用7200型分光光度计，680 nm波长条 件下测光吸收值。以30 C下每分钟水解酪蛋白产生1临酪氨酸作为1个酶

5、活力单位（U）。1.3.2 脂肪酶活力的测定 采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法4。取缓冲液2.5 mL和聚乙烯醇橄榄油乳化液2 mL于锥形瓶中，30 C保温5 min,然后 在锥形瓶中加入1.0 mL酶液，30 C下反应30 min后立即加入95 %乙醇 5.0 mL终止反应，再加3滴酚酞，用0.05 mol/L氢氧化钠滴定，对照组在 加入95 %乙醇后再加酶液，其余与实验组相同。以30 C下每分钟作用于 聚乙烯醇橄榄油乳化液产生的脂肪酸最后消耗1 mL 0.05 mol/L的NaOH 为1个酶活力单位（u）。1.3.3 淀粉酶活力的测定 采用 3,5-二硝基水杨酸比色法4 ,略有改动。取0.6

6、65 mL预测粗酶液于各试管，再分别加入相应pH值的缓冲液0.665 mL, 混匀，将反应组置于30 C恒温水浴锅中预热510 min,同时对照组在 100 C沸水中煮510 min （使酶失活）。再向反应组和对照组试管中加入已 预热的1 %的淀粉溶液0.67 mL,摇匀，于30 C水浴反应20 min后再加入 2 mL的3,5-二硝基水杨酸，摇匀。立即放入100 C沸水中显色5 min,使酶 失活并终止反应,流水冷却后稀释10倍,用7200型分光光度计, 490 nm 波长条件下比色，测光吸收值。以30 C下每分钟水解淀粉产生1 mg麦芽 糖作为一个酶活力单位（U）。1.3.4纤维素酶活力测

7、定 采用羧甲基纤维素钠水解法4。取1.0 mL酶液于 各试管，再分别加入相应pH值的缓冲液3.0 mL, 0.5 %羧甲基纤维素钠溶 液0.8 mL,蒸馏水0.6 mL,混匀40 C水浴糖化30 min,取出立即置于沸水 浴15 min,对照组先置于沸水浴中使酶失活，其余步骤相同。取0.5 mL糖 化液加3,5-二硝基水杨酸1.5 mL，沸水浴15 min，冷却，加蒸馏水3 mL, 用7200型分光光度计，于550 nm处测吸光值。以40 C每分钟催化纤维素 生成1.0 Mg葡萄糖为一个酶活力单位（U）。1.4 pH梯度的设置利用不同pH值的缓冲液来调节反应的pH条件。实验中共使用4种 缓冲液

8、，以KC1-HC1配制pH 0-5-1-5的缓冲液，以Na2HPO4 -柠檬酸配制 pH 2.2-8.0的缓冲液，以巴比妥钠-盐酸配制pH 8.0-9.6的缓冲液，以甘氨 酸-氢氧化钠配制pH 10.0-10.6的缓冲液。胃消化酶的pH值范围为1.0、1.5、 2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 和 8.0,共9 个 pH值梯度。肠和胰脏消化酶的 pH 值范围为 4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、9.6 和 10.0，共 9 个 pH 值 梯度。1.5 温度梯度的设置设置15 C、20C、25 C、30 C、35 C、40 C、45 C、50 C、55 C 和

9、60 C共10个温度梯度，根据上面所测胃、肠和胰脏各自的最适pH值， 选择对应的缓冲液按上述方法分别测定胃、肠和胰脏在不同温度条件下的 消化酶活力。1.6数据处理实验数据取3次测量的平均值（瓦土SD）用单因素方差分析（one-way ANOVA）对不同部位消化酶的活力进行差异显著性比较，P0.05为差异显 著。2 结果2.1 牛蛙消化酶的分布牛蛙消化系统不同部位蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力见表 1。由表 4-1 可知,牛蛙消化系统三种消化酶的活力均以胰脏最高,显著高于其它 部位（P0.05）。在消化道中，蛋白酶活力以胃最高，显著高于食道和肠道 （P0.05）。脂肪酶活力在消化道各段由前至后逐渐

10、增加，肠道脂肪酶活力 显著高于胃和食道（P0.05）,其中后肠脂肪酶活力显著高于前肠和中肠（P0.05）。淀粉酶活 力主要分布于肠道，肠道各段淀粉酶活力显著高于胃和食道(P0.05)。食道和胃淀粉酶活力大小相当， 差异不显著(P0.05)。我们还对牛蛙消化道纤维素酶的活力进行了检测， 结果未观察到明显的酶活力。表4-1牛蛙消化酶分布n=3; X 士SD; Unit: U/g食道esophagus胃stomach前肠foregut中肠midgut后肠hindgut胰脏pancreas蛋白酶活力Activity of protease14.5b2.5116.6a17.37.98b4.724.7b8

11、.03.63b1.6118.6a24.3脂肪酶活力Activity of lipase淀粉酶活力0.14d0.010.18d0.020.27c0.020.29c0.050.36b0.073.67a0.10Activity ofamylase0.14c0.010.17c0.021.02b0.091.12b0.081.05b0.043.34a0.05注：上标不同的平均值间差异显著，a b c d (P S6gj活酶粉淀3 讨论3.1 牛蛙消化酶的分布本研究在牛蛙消化系统中检测到了蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，未 检测到明显的纤维素酶活力。蛙类通常属肉食性动物，但牛蛙消化系统中 具淀粉酶活力，这提示在

12、配制牛蛙饲料时可适当添加淀粉性成分。牛蛙消化系统中蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力均以胰脏最高，表明 胰脏是牛蛙消化酶的重要分泌器官。不同消化酶在牛蛙消化道中的活力分 布差异较大，蛋白酶的活力以胃中最高，这与黑斑蛙11和虎纹蛙12的相一 致。脂肪酶活力则主要分布于肠道，特别是后肠。淀粉酶活力亦主要在肠 道，以中肠较高。牛蛙消化酶活力的分布型表明其对食物中蛋白质性成分 的消化主要在胃中进行，而对脂肪和淀粉性成分的消化主要在肠道中进 行。根据牛蛙的这种消化特点，在配制牛蛙饲料时，不妨考虑制作复合饲 料，外层以蛋白质性成分为主，内层适当包裹淀粉和脂肪性成分。牛蛙吞 食饲料后，首先在胃中消化饲料外层的蛋白

13、质性成分，在肠道中进一步消 化饲料内层的淀粉和脂肪性成分，这样不仅可提高牛蛙的消化效率，而且 可提高饲料的利用率，降低养殖成本。3.2 pH对消化酶活力的影响酶的活力受pH的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH范围内 才能表现出其活力。有关pH对蛙类蛋白酶活力的影响有一些报道，黑斑蛙11和虎纹蛙12的胃、肠道和胰蛋白酶的最适pH值分别为1.5、7.4和9.6，而 黑眶蟾蜍13的胃蛋白酶最适pH值为2.2，肠蛋白酶最适pH值为9.6。牛蛙胃、 肠道和胰蛋白酶的最适pH值分别为2.2、7.4和9.6，与这些蛙类基本一致。 有关pH对蛙类脂肪酶和淀粉酶活力影响的报道较少，牛蛙胃、肠道和胰脂 肪酶

14、的最适pH值分别为2.2、7.4和8.0，其胃脂肪酶的最适pH值比鱼类2,3 的低，这可能与牛蛙胃内的生理pH值较鱼类低有关。肠道脂肪酶的最适pH 值与多数鱼类2-4和中华鳖10的相似。牛蛙胃、肠道和胰淀粉酶的最适pH值 分别是7.0、8.0和9.6，在中性或碱性范围，这与多数鱼类5-8和中华鳖10淀 粉酶的最适pH在碱性或中性偏酸性范围内相一致。牛蛙胃淀粉酶活力受 pH影响曲线出现了两个峰值(pH2.2和pH7.0)，这与许氏平鮋(Sebastes schlegeli) 5的胃淀粉酶相似，导致这种情况的原因尚不清楚。我们测得牛蛙 饱食后胃和肠道内生理pH值分别为2.0-3.0和7.09.0,

15、可见牛蛙饱食后消化 道各部位的生理pH与不同消化酶的最适pH是相适应的。3.3 温度对消化酶活力的影响牛蛙属变温动物，其适宜的生存温度范围为5-35 C,牛蛙蛋白酶和脂 肪酶最适温度要远远高于其栖息的环境温度，这种现象在鱼类也普遍存在 3,8,9。温度对酶反应的影响很大，酶的蛋白质本性决定了其对温度的高度 敏感性，温度升高，一方面使酶促反应的速度加快，另一方面也加速酶活 力的丧失，因而最适温度随反应时间延长而下降。在离体测定条件下，酶 作用时间较短，而在正常生活条件下，酶消化食物所用的时间相当长，这 就可以解释为什么最适温度会高于生理温度的现象。但在离体条件下测定 的消化酶最适温度可反映消化酶

16、的热稳定性和温度对酶活力的影响规律。 牛蛙消化道蛋白酶的最适温度为45 C或50 C,脂肪酶的最适温度为50 C, 而淀粉酶的最适温度仅为35 C,表明牛蛙蛋白酶和脂肪酶的抗热性比淀粉 酶强。根据牛蛙消化酶的这一特性，在牛蛙的人工养殖中，当环境温度升 高时，在适当增加投喂量的同时，可考虑在饲料中适当增加蛋白质和脂肪性成分的配比，减少淀粉性成分的配比。参考文献1 曾中平牛蛙的养殖技术M.北京:金盾出版社,1999.2 吴仁协,戈薇,洪万树 ,等.大弹涂鱼成鱼消化酶活性的研究 J .中国水产科 学,2007,14(1):99-105.付新华，孙谧，孙世春，等大菱鲆消化酶活力J中国水产科学,2005

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