试验六1、小鼠采精方法的研究

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1、实验六、小鼠采精方法中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVEMEDICINE2005年4月第15卷 第2期April, 2005 Vol.15 No.2郑新民,李聚学,魏 雁,乔宪凤,周荆荣(湖北省农科院生物技术研究所,武汉 430072小鼠是世界上研究最为详尽的哺乳类动物1。但是目前人们仍然是通过手术法从小鼠附睾中获取精子,国内外尚无小鼠非手术法采精的报道。手术法采精为众多的科学研究带来了不便:(1)手术法采精必须将雄鼠处死,分离其附睾和输精管来获取精子,过程繁琐,费时费工,且造成不必要的经济浪费2。另外,从附睾中获取的精子由于缺少副性腺中的诸多有益成分,

2、精子品质难以保证3;(2)不利于小鼠生殖生理的研究,在医学上,人们都是通过“杀鸡取卵”式地宰杀大量的雄鼠来获取精子进行科研分析4-6,不但造成了很大的经济浪费,而且增加了实验的误差和难度;(3)不利于某些动物模型的建立,例如,由于小鼠精子获取繁琐,人工授精技术不易建立,精子载体转基因技术尚无理想的动物模型,这极不利于该项研究的开展7。由此可见,建立一种方便快速的小鼠非手术法采精技术对解决小鼠手术法采精中存在的问题、小鼠生殖生理的研究和建立某些小鼠动物模型都是很有意义的。1 材料和方法1.1 实验动物SPF级昆明小白鼠雄鼠,购自湖北省预防医学科学院。合格证号为:SYXK(鄂)20035853。1

3、.2 小鼠假阴道抽吸器的制备小鼠假阴道的制作:取一段长约2 cm,内径8 mm的软质透明塑料管,在其内侧套上一层厚度约0.1 mm的胶膜,胶膜要求透明且有良好的弹性。在塑料管中部钻一直径为2 mm的小孔,将一外径与小孔相当的硬质插管插入小孔中,深度与塑料管管壁厚度相当,小孔周围用强力胶水密封,向小管中轻轻吹入空气即可将塑料管内侧胶膜充起。将制好的小鼠假阴道与胶头吸管相连,小鼠假阴道抽吸器即制作完毕。1.3 电刺激采精仪的制备电刺激采精仪由电刺激发生器和直肠探子两部分组成。电刺激发生器由交流变压器、电流表、电压调节器,变频器,电源开关等部件组成。直肠探子可用小塑料管自行制成,探子上装有电极,电极

4、与电刺激发生器插座用电线相连。电刺激采精仪的特点:电压连续可调,范围为020 V;频率选择范围为050 Hz;通电间歇时间可根据不同情况自行选择。1.4 小鼠采精实验1.4.1 小鼠保定:利用筒式法保定小鼠,小鼠保定筒可用与小鼠体躯相似的塑料筒制成,塑料筒两端钻有插孔,一端锯有缺口。待小鼠钻入筒内后,迅速将铁钉插入插孔中,限制小鼠伸缩,即可将小鼠保定。将保定好的小鼠在筒内旋转,使其生殖器暴露在缺口中,以利精液收集。1.4.2 小鼠徒手法采精:小鼠保定后,用75%的酒精将其生殖器消毒,待酒精挥发后,用手指轻轻按摩小鼠生殖器。1.4.3 小鼠假阴道抽吸法采精:小鼠假阴道消毒后,用凡士林将其内侧胶膜

5、润滑,从插管中轻轻吹入空气,待内侧胶膜充起后,迅速将插孔堵住,以防气体外逸。用手轻轻按摩小鼠生殖器,待小鼠阴茎勃起后,将阴茎迅速吸入37预热后的假阴道内,然后用手指挤压吸管胶头,小鼠阴茎便在管腔负压的作用下做活塞运动,这时可向假阴道内不断吹入气体,以增加胶膜对小鼠阴茎的压力。抽吸频率可由慢至快,直至小鼠射精。1.4.4 小鼠电刺激采精:直肠探子用75%的酒精消毒后,用石蜡油或凡士林将其润滑,轻轻地插入小鼠直肠中,深度约2.53 cm。如在插入过程中遇有阻力,则表明小鼠粪便尚未排出,这时将探子退出,用手指轻揉小鼠下腹部,促使小鼠排便,然后再将直肠探子插入。打开电刺激采精仪,以频率为20 Hz,起

6、点电压为2 V,占空比为5P5 s秒通电刺激,刺激30 s后,电压上升12 V,重复以上步骤,直到小鼠生殖器充血勃起而向外突出,这时应作好集精准备。1.4.5 精液的收集:小鼠精液刚射出时为白色粘稠液体,但会在短时间内凝固成白色固体,因此应迅速收集精液到有稀释液的离心管中。如伴有淡黄色液体流出,则为尿液,应用灭菌纱布迅速擦干,以免污染精液。另外,在射精过程中,有透明液体伴随精液流出,可用移液枪将其收集。1.5 总精子量和精子活率的测定反复吹吸精液,待精子在精液稀释液中充分游离后,用血细胞记数板测定精子的密度和活率,然后根据稀释液的体积和所测定的精子密度计算总精子数。表2 射精不同阶段精子量和活

7、率的比较Tab.2 Comparisons of spermatozoa quantity andmotility at different ejaculation stages项目 1 2 3 4Item First Second Third Fourth精子量(亿)Semen quantity 0.05 1.2 0.8 0.15活率(%) 40 82 83 83Motility %从表2可以看出,第一阶段射出的精子量(0.05亿)很小,活率很低(40%)。精子主要富集在第二(1.2亿)和第三阶段(0.8亿),且所获得的精子活率较高(分别为82%和83%)。第四阶段获得的精子量较少(0.15

8、亿),但活率较高(83%)。2.3 小鼠重复采精效果用假阴道抽吸法和电刺激法采精后,间隔5 d,用同样的方法重复采精,结果见表3。表3 假阴道抽吸法重复采精结果Tab.3 Results of repeated collection of semenby artifical vagina pump重复次数 采精成功率(%) 精子量(亿) 活率(%)Frequency Rate % Semen quantity Motility % (in hundred million) 第一次采精(First) 77a 2.3b 80c第二次采精(Second) 73a 2.0b 81c注:同一竖栏内相同标

9、注者表示差异不显著(The same superscripts ina vertical column show no difference)表4 电刺激法重复采精结果Tab.4 Results of repeated semen collection by electroejaculation重复采精 采精成功率(%) 精子量(亿) 活率(%)Frequency Success rate % Semen quantity Motility %第一次采精(First) 70a 2.0b 82c第二次采精(Second) 75a 2.1b 83c注:同一竖栏内相同标注者表示差异不显著(The s

10、ame superscripts in avertical column show no difference)从表3和表4可以看出,与首次采精相比,假阴道抽吸法和电刺激法对小鼠进行重复采精的成功率(73%和77%,75%和70%)、平均总精子量(2.0亿和2.3亿,2.1亿和2.0亿)和精子活率(81%和80%,83%和82%)均差异不显著。3 讨论(1)小鼠个体小,其生殖器也较小,直接用手指进行徒手按摩很难控制力度,不能对小鼠阴茎进行有效的刺激,且易导致小鼠生殖器官的感染,对8只小鼠用徒手法进行了采精尝试,无一例采出精子,故我们认为徒手法采精不适合于小鼠。小鼠假阴道抽吸采精器则能很好的解决

11、这一问题,它能较好地控制假阴道内壁对小鼠阴茎的压力,其刺激频率可以通过控制吸管抽吸频率得以调节,采精成功率可达77%。电刺激采精是通过脉冲电流刺激生殖器引起动物性兴奋并射精来达到采精目的8。该法在牛、狐狸、鹿、海狸鼠和多种野生动物上已成功地应用8-11。我们将其应用于小鼠,获得了70%的采精成功率。长期以来,人们已习惯于手术法从小鼠附睾中获取精子,而非手术采精则被忽视。我们的实验结果却表明:小鼠非手术法采精是完全可行的。(2)与其他动物不同,小鼠精液在射出体外的瞬间即发生凝固现象,这与小鼠的特殊性腺凝固腺有关12。凝固腺分泌促精液凝固的蛋白成分,当射出的精液在体外遇到空气,小鼠精液便迅速发生凝

12、固现象,精子主要附着在凝固物上。凝固物的作用是在刚交配的母鼠阴道中形成阴道栓,阻止精子外流。与猪等家畜相似,小鼠射精也分成多个阶段,第一阶段射出的精液精子含量少,且以死精居多,精子活率低13。小鼠精子主要富集在第二和第三阶段,这两阶段射出的精液精子活率高(81%82%),末尾射出的精液所含的精子较少。(3)小鼠重复采精实验表明,小鼠可在休息一段时间后重复采精,假阴道抽吸法和电刺激法对小鼠采精无明显影响。假阴道抽吸器主要是根据小鼠自然交配的特点制作而成,对小鼠生殖器刺激小,不会对生殖器造成器质性损伤。电刺激法在牛、狗熊、熊猫、小灵猫等多种动物上都已证明其对动物生殖功能无不良影响,我们在采精中发现,在操作得当、刺激电压适当的情况下,电刺激采精对小鼠重复采精无显著影响8、14-16。在电刺激采精中应当注意,采精电压不宜过高,一般以45 V为宜,不要超过10V,过高的电压易灼伤小鼠生殖器及直肠壁,还可造成小鼠阴茎过度充血,甚至出血。另外,在电刺激采精时,对小鼠轻微麻醉保定效果较好,这样操作方便,又可避免因小鼠剧烈挣扎而造成直肠探子对小鼠直肠的损伤。