枯草芽孢杆菌的分离

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1、枯草芽抱杆菌的分离，纯化和培养摘要：枯草芽抱杆菌，是芽抱杆菌属的一种。单个细胞0.70.8x2 3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽 抱060.9x1.015微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽抱 形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体 培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤 核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败 的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。并且耐氧化；耐挤压；耐 高温，能长期耐60C高温，在120C温度下能存活20分钟；耐酸碱,

2、 但是不耐低温，在-4和-80度冰箱中会很快死亡。关键词：枯草芽抱杆菌的培养枯草芽抱杆菌的分离枯草芽抱杆菌的纯化 前言:枯草芽抱杆菌在饲料中及生物肥发酵或发酵床制作中应用 较为广泛，也可用做市政和工业污水处理，工业循环水处理，腐 化槽、化粪池等处理，畜牧养殖动物废料、臭味处理，粪便处理 系统，垃圾、粪坑、粪池等处理。畜牧、家禽、特种动物及宠物 养殖，水产养殖。还可以与多种菌种混配，是一种多功能的微生 物。枯草芽抱杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、 制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽抱杆菌耐酸在酸 性胃环境中能保持活性，可

3、以耐唾液和胆汁的攻击，是可直达大小肠的活菌。以抱子状态进入消化道后，迅速由休眠状态复活， 在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，消耗掉肠道内大量氧气， 并能产生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微 生物的繁殖，抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的生长， 从而预防腹泻、痢疾等肠胃道疾病。在快速繁殖过程中，产生大 量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶（特别是碱性蛋白酶）、 糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，能降解植物性饲料中复杂的有机物， 从而促进消化吸收，提高饲料利用率，防止动物消化不良。枯草 芽抱杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌 氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道 P

4、H值，间接抑制 其它致病菌生长；刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫 功能，提高群体免疫力；枯草芽抱杆菌菌体自身合成a淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消 化酶类一同发挥作用；能合成维生素 B1、B2、B6、烟酸等多种 B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。1 材料与方法11材料含有枯草芽抱杆菌的菌悬液，牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼 脂、蒸馏水1-1-1样品试管，试管架，接种环，记号笔，酒精灯,搪瓷杯，玻璃漏斗，纱布， SW-CJ-2FD双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司制造，DF205电热鼓风

5、干燥器北京医疗设备工厂（160度2小时），PYX-DHS-50X65-BS- II隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂, ML-2080EG海尔微波炉青岛胶南海尔微波制品有限公司,YX280B手 提式不锈钢蒸汽消毒器上海三申医疗器械有限公司12方法 1培养基制备，平板划线培养培养基制备1, 要准确称量试剂，琼脂最后放入搪瓷杯中；先用少量水将试剂充 分溶化后，前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分，最后再补足 需要的水，并且要记下补足水后，刻线的位置；2, 调节培养基适合的pH值（本实验需要的培养基适合pH,用自来水 调配的即可）；3, 放到电热炉上加热，加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适

6、 当补充因蒸发而损失的水量。（可加热促进各成分溶解）4, 将玻璃漏斗置于铁架台生，再把纱布放在漏斗中，将上述培养基倒 入其中过滤至透明。5, 将过滤后的培养基乘热分装于试管或三角瓶内（试管内每支装5ml； 三角瓶中装100150ml）,塞好棉塞（注意不要污染棉塞和瓶口）用报 纸包扎好，挂上标签，注明何种培养基。6, 培养基使用高压蒸汽灭菌，灭菌锅内加入一定量的水。将待灭菌 的物品放入锅内，调整好排气管的位置，并关严锅盖。（器物不能装 得太满。）接通电源，进行加热。当高压锅排出大量气体时，开始计 时5分钟，即排除了高压锅内的冷空气，可将排气阀关闭。当压力达 1.05kg/cm2（灭菌器内的温度为

7、121C）即开始灭菌，使其维持30min 左右。灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀， 然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩余水。7. 等试管棉塞水分充分蒸发后取出，直接摆成斜面。8. 待培养基冷却后置于37C恒温箱内培养24h,若无菌生长则放入冰 箱或阴凉处保存备用。平板划线培养1 取无菌培养皿，加热培养基，当其冷至45C左右时，右手拿装有 培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底， 拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养 皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充 分混匀，冷凝后即成平板。2用接种环挑取一环样品，

8、左手拿培养皿，中指、无名指和小指托 住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将 皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（切勿 划破培养基）。划线完毕盖好皿盖，35C培养2448h后观察结果。2从平板到斜面接种培养1从平板培养上找岀合适的单个菌落，用记号笔画出来，便于斜面接 种。2右手拿接种环，在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试 管的其余部位也过火灭菌。3将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将 两支试管的棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓 过火焰。4将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内。先冷却，而后再用环挑取少 许菌种，

9、将接种环抽出并迅速伸入待接种试管底部，在斜面上由底部 向上划线。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最后再次烧 红接种环，则接种完毕。5将试管在恒温箱中培养24h48h2 结果与分析2 - 1平板划线培养的结果与分析1, 从平板划线的培养结果可以看出，最初画的区域菌落是生长呈连 续带状，随着接种环上菌悬液越来越少，菌落呈渐渐分散趋势，就会 出现单个的菌落。2, 平板培养基中除了枯草芽孢杆菌外，还有三种未知的菌，1呈黄色 圆状，大小在2mm左右，表面突起有光泽，可能为金黄色葡萄球菌， 2呈红色圆状，大小在1mm左右，表面突起有光泽，可能为酵母，3 呈白色棉絮状，含黑灰色的孢子，大小在2cm左

10、右，可能为霉菌。可能由于培养消毒不彻底，或是倒平板时带入杂菌3, 由于培养基未摇匀，培养基两侧的厚度不同，培养基薄的地方菌 落颜色有些偏灰白色，显得更干燥;培养基厚的地方菌落颜色较白, 较为湿润。4, 由于培养基在倒入培养皿平放在桌上转动时用力过大，培养皿的盖 子上连粘着培养基，菌落会长到培养皿的盖子上。2 2斜面接种培养的结果与分析1 Z字画的距离太大没能充分利用培养基2 - Z字左右两边的培养基没能充分利用3有的试管中有类似于霉菌，可能由于接种时，未为试管消毒，或 者是棉塞被污染了3讨论（针对整个论文内容讨论）1微生物的适应能力强并且易变异，玻璃器皿均需灭菌后才能使用， 将待灭菌的物品放入

11、恒温箱，将温度调节至160C并维持2h, 玻璃器 皿的灭菌有利于实验的顺利进行，并且可以减少干扰项，起到分离纯 化的目的。2实验中的瓶塞，试管塞在操作中，均不离开手与台面接触，防止塞 子被污染，不利于实验的结果。3培养基加热后水分的蒸发要补足，防止培养的浓度过高不利于菌类 的生长4高温灭菌锅使用，要严格按照操作进行，灭菌锅在使用要加入足够 的水，防止干锅；灭菌锅的盖子对称锁紧，这样可以保证灭菌锅的密 封；当排气阀排出大量气体达到5分钟时，才能关闭排气阀，否则灭 菌锅内的温度将低于所需的温度；灭菌时间的充足，是灭菌效果的保 证；灭菌后须待压力降至零时，才能打开排气阀，等温度降低后才能 打开灭菌器盖，否则试管内的液体由于内外压力差太大会喷射出；5制平板培养基需在无菌的操作台上完成，操作台在使用前，需通电用紫外线杀菌30分钟，使用时关掉紫外线，由于台内紫外线的照射产生了臭氧操作前需适当的通风6枯草芽抱杆菌要在适宜的条件下培养3到5d4结论（对最终分离得到的菌种进行大致的形态描述）在试管的底部菌落大面积成片生长，后面沿着接种环画的线生长为大约宽4mm的带状，着色均匀，菌落表面粗糙不透明，污白色，有褶 皱，边缘为有缺刻。