本科生实验操作及作业

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1、 食品微生物检验学 实验教学内容实验一：食品中菌落总数的检验 实验二：食品中大肠菌群的测定实验三：食品中沙门氏菌检验实验四：体外抑菌实验实验一：食品中菌落总数的检验一、实验目的（1） 学习和掌握平皿菌落计数的基本方法和原理。（2） 了解菌落总数测定在对被检样品进行卫生学评价中的意义。二、实验原理平皿菌落计数法又称标准平板活菌计数法（standard plate count，简称SPC法）是最常用的一种活菌计数法。三、实验材料（一）检样 ：自来水（二）试剂及配制 营养琼脂培养基（又称牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）-121,20min。 无菌生理盐水：8.5g氯化钠溶解于1000ml蒸馏水-121,15

2、min。 孟加拉红培养基-115,30min.( 实验用的是虎红琼脂培养基)（三）仪器与设备 恒温培养箱，超净工作台、天平、灭菌锅、电炉。无菌培养皿、无菌移液管（1ml 、10ml）、无菌试管、试管架、酒精灯、75%酒精棉。四、实验步骤细菌总数1、取样及稀释：无菌试管取样，在超净工作台进行稀释。取6支灭菌试管，分别加入9ml无菌生理盐水，用1ml灭菌吸管吸水样加入其中一支，制成1：10稀释液；另取1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。如此每递增稀释一次，即换用1支1

3、ml灭菌吸管。根据食品卫生检验标准要求和检样的菌落数量，选择3个连续适宜稀释度即100、101、102，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。稀释液移入平皿后，应及时将凉至46营养琼脂培养基注入平皿15ml20mL，并转动平皿使与稀释检样混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。2、 培养待琼脂凝固后，翻转平板，置（361）恒温箱内培养（482）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1mL样品所含菌落总数。 四、检样中细菌菌落总数的计算与报告1、菌落计算方法（1）菌落计数方法做平板菌落

4、计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。（2）菌落计数的报告平板菌落数的选择 选取菌落数在30300 CFU之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，稀释度的选择应选择平均菌落数在30300 CFU之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30300之间， 按以下公式计算：N = 样品中菌落数C = 含适宜范围CFU的平板菌落数之和n1 = 第一稀释度（低稀释度）平板个数n2 = 第二稀释度（高稀释度）平板个数d = 稀释因子（第一稀释度） 若所有稀释度的平均菌落

5、数均大于300 CFU，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之，若所有稀释度的平均菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告若所有稀释度及样品原液均无菌落生长，则以小于l乘以最低稀释倍数报告之，若所有稀释度的平均菌落数均不在30300 CFU之间，其中一部分大于300 CFU或小于30 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。菌落数的报告菌落数在1100时，按实有数字报告。菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2

6、 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。3、实验结果与记录稀释度菌落数皿号100101102报告数12稀释液对照皿空白皿判定所检测样品菌落总数是否符合国家标准五、分析与讨论1、食品检验为什么要测定细菌菌落总数？2、食品中检出的菌落总数是否代表该食品中的菌落总数？为什么？霉菌和酵母菌菌落总数的测定1、 取样及稀释：同上2、 待琼脂凝固后，翻转平板，置25-28恒温箱内培养

7、3d取出观察。 3、 计数：计选取菌落数10-150之间。实验二：食品中大肠菌群的测定一、实验目的（1）学习和掌握大肠菌群测定方法。（2）了解大肠菌群测定在对食品卫生检验中的意义。二、实验原理大肠菌群系指一群能在37经24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（themostprobablenumber-简称MPN）表示。三、实验材料（一）检样

8、 ：自来水（二）试剂及配制 乳糖胆盐发酵管-121,20min。乳糖发酵管-121,20min。伊红美蓝琼脂（EMB）-121，15min。革兰氏染色液：溴甲酚紫，结晶紫染液，碘液，95%乙醇，番红复染液 （三）设备和材料温箱(36土1)、水浴锅(44土0.5)、天平、显微镜；平皿、试管、发酵管、吸管（移液管或移液枪）、载玻片、接种针。四、实验步骤(一)检验程序大肠菌群检验程序见图(二)操作步骤采样及稀释根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计,选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。培养检验1、乳糖初发酵试验即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细

9、菌。选择3个稀释度，将待校样品接种乳糖服盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置(36土1)培养箱内，培养(24土2)h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程序进行。如有产生者，则按下列程序进行。2、分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板，置(36土1)温箱内，培养18h24h，：然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和证实（复发酵）试验。3证实（乳糖复发酵）试验即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发

10、酵乳糖产生气体。在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群12个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置(36士l)的温箱内培养(24土2)h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性反应的无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。4报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表(见表54)，报告每100mL(g)食品中大肠菌群的最可能数。4.1试验结果表 接种量管号发酵反应结果有无典型菌落革兰氏染色结果复发酵反应结果最后结论 +或-0.1ml1230.01ml1230.001ml123注：填写初发酵与复发酵结果应以下列符号表示。“-”

11、表示不产酸也不产气，培养基为紫色；“+”表示只产酸而不产气，培养基变黄色；“”表示产酸又产气，培养基变黄，并有气泡。4.2结果报告 根据证实大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表(见附录)报告每100ml(克)大肠菌群的最可能数.6.附件100ml（g）检样中最近似值(MPN)表使用三管法，接种量分别为0.1，0.01和0.00lg。大肠菌群MPN检索表阳性管数MPN95%可信限1ml（g）30.1ml（g）30.01ml（g）3100 ml（g）下限上限000000000123303060905900000111101233060901205130000022220123609012016000

12、003333012390130160190111100000123407011015051020021011111111012370110150190103023036011112222012311015020024030360111133330123160200240290222200000123901402002601030360370222211110123150200270340307044089022222222012321028035042040100470150022223333012329036044053033330000012323039064095040701501200

13、1300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000 注：本表采用3个稀释度0.1g(mL)、0.0lg(mL)和0.001g(mL)，每个稀释度接种3管。表内所列检样量如改用1g(mL)、0.10(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍：如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时，则表内数

14、字应相应增加10倍，其余类推。查表注意:在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的1ml(g),系指原样品的1ml(g)数,并非样品稀释后的1ml(g)数,对固体样品更应注意.如固体样品1g经10倍稀释后,虽加入1ml量,但实际其中只含有0.1g样品,故应按0.1g计,不应按1ml计.实验三：食品中沙门氏菌检验一、实验目的1、掌握食品中沙门氏菌的检验原理。2、 掌握食品中沙门氏菌的检验方法。二、实验原理沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。 形态特征：革兰氏阴性，大小为130.40.9m的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。四、沙门氏菌检验程序