手足口病标本采集及检测技术方案

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1、附件 1：手足口病标本采集及检测技术方案一、采集标本的种类、保存和运输（一）粪便标本。采集病人发病 3 日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量 58g/ 份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签， 4暂存 12 小时内送达实验室， -20 以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于 -70 冰箱。（二）咽拭子标本。采集病人发病 3 日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位， 应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有 3 5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的 15ml 外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆

2、，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。 4暂存并在 12 小时内送达实验室， -20 以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于 -70 冰箱。（三）血清标本。各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71 和CVA 16感染的手足口病患儿的双份血清。采集急性期（发病07d）和恢复期（发病 1430d）双份配对血清用于阐明和分析EV71 和CVA 16感染后 IgG 和IgM 抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。静脉采集 35ml 全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到 2ml 外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。将血

3、清置于 -20 以下冰箱中冷冻保存。（四）疱疹液。在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。先用 75的酒精疱疹周围的皮肤进行消毒， 然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液， 迅速将棉签放入内装有 3 5ml 保存液（含 5牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。所采集标本 4暂存立即（ 12h 内）送达实验室， 20以下低冷冻保藏，需长期保存的标本存于 70冰箱。（五）肛拭子标本。采集病人发病 3 日内的肛拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，

4、从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后, 迅速将棉签放入装有 3 5ml 保存液（含 5牛血清细胞维持液）的15ml 外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。（六）尸检标本。采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。每种组织应多部位取材，每部位应取23 份约510g 的组织，淋巴结 2 个，分别置于 15ml 50ml 无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。（七）脑脊液标本。出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。采集时间为出现神

5、经系统症状后 3 天内，采集量为 1.0 2.0 ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中， 4暂存立即(12 h 内 ) 送达实验室， 20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于 70冰箱。但 EV71 感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到 EV71 病原。临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输， 12 小时内送达实验室。依照人间传染的病原微生物名录，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按 B 类包装，置于冷藏保存盒内运输， 尽量缩短运输时间。可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。在送到省、地、市级CD

6、C实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。 在上送标本的同时，需附带相关的手足口病病例临床标本采样登记表。二、标本采集注意事项在手足口病的实验室诊断中， 从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。 用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含 5牛血清维持液。用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。 为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。不能立即检测的标本应冷冻保存。对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。标本保存液的配置见下表：保存液Eagle s 液( MEM )80.5ml3L- 谷氨酰胺 2

7、00mM1.0 ml胎牛血清5.0ml7.5 NaHCO3 溶液3.5ml青、链霉素10ml（各 10000U/ ml ）三、实验室检测操作流程（一）病毒分离。1. 试剂配置（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：生长液（ GM ）维持液（MM）Eagle s 液( MEM )86.5ml92.5 ml3L- 谷氨酰胺 200mM1.0 ml1.0 ml胎牛血清10.0ml2.0 ml7.5 NaHCO3 溶液2.5ml3.5 ml青、链霉素1.0ml1.0 ml（各 10000U/ ml ）（2）粪便标本和肛拭子的处理液完全 PBS 液中加入 PS 溶液，终浓度为青霉素100u/ ml，链霉

8、素为100g/ml。完全 PBS 液的配置：取以下 1 份B 液和 1 份C 液加到8 份A 液中即为完全 PBS 工作液。A 液：试剂品名加入量NACL8.00 gKCL0.20 gNa2HPO4( 无水 )0.91gKH2PO40.12g用600800ml 蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至 1000ml， 10psi（ 70Kpa） 15 分钟高压灭菌，即为不完全 PBS 工作液（不含钙镁离子）。B 液：试剂品名加入量MgCl2.6 H2O0.10 g溶解于100ml蒸馏水中，10psi（ 70Kpa）15分钟高压灭菌。C 液：试剂品名加入量CaCl20.10g溶解于 100ml 蒸馏水中

9、， 10psi（ 70Kpa）15 分钟高压灭菌。2病毒分离细胞系许多细胞系可支持人肠道病毒（如 EV71、CVA 16）生长。对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含 EV71、CVA 16 等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。HEp-2 细胞，来源于人喉癌上皮细胞。3标本的处理（ 1）粪便标本和肛拭子的处理操作步骤：1）在离心管上标记标本号；2）每管中加入 10mlPBS、 1g 玻璃珠、 1ml 氯仿；3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g 加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为 2ml；4）剩余的原始

10、标本最好留在原容器中，冻存于20；5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在 1500g 条件下离心 20min ；7）在生物安全柜中将每1 份标本的上清液分别吸入2 个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1 次）；8）1 管粪便悬液冻存于20作为备份，另 1 管存于 48以备接种。（2）疱疹液标本的处理疱疹液标本通常直接用于RNA 提取或病毒分离。（3）脑脊液标本的处理脑脊液标本通常直接用于病毒分离。（4）咽拭子标本的处理咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40 下），以洗下拭子上粘附的病毒及含

11、有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。然后在 4条件下， 10000rpm 离心 20min ，用上清接种到细胞上或直接提取 RNA 。如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。4接种和观察（病毒分离）（ 1）通常使用 ml 的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液 1.5 ml。显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。一个健康的单层细胞会在传代后 48 小时左右形成；（ 2）倒掉生长液（ GM ），换上 1 1.2 ml 的维持液（ MM ）；（ 3）每一份标本需要同时接种 2 支RD 细胞和 2 支HEp-2 细胞，正确标记每支

12、细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；（ 4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；（ 5）每支试管接种 0.2 ml 的标本悬液，培养温度要求 36。（或者使用吸附的方法接种病毒：接种标本前，倒掉生长液（ GM ），每支试管接种 0.2 ml 的标本悬液，培养温度为 36；吸附 1 小时后，换上 1.5 ml 的维持液（MM ）。同样每份标本需同时接种2 支 RD 细胞和 2 支 HEp-2 细胞。（ 6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；（ 7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录

13、CPE（ 1+4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+， Ct 值 35.0 的样本为临界值。 Ct 值38.0 的样本或无数值的标本为阴性。（ 2）OneStepReal-timePCR 法同时检测 EV71 和 CVA 16 核酸（双通道检测） 双通道可以同时检测 EV71 和CVA 16 核酸 , 在提取核酸后短时间 (2.5 小时 ) 内检测到标本中是否含 EV 71 或 CVA 16 核酸。反应体系配置反应体系共 25l，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用 5l 模板量），不够部分以水补足。如选用另外试剂盒，反应体系及条件随之变化。a. 先将试剂解冻

14、，从试剂盒中取出相应的试剂，反应液在室温融化后，瞬时离心，按 n+1 配置 25 l 反应体系（ n=样本数 +1 管阳性对照+1 管阴性对照），每个测量反应体系配置如下表：b. 将下述反应液混匀离心后， 按照每管 20 L 分装于适用的 PCR 管中。试剂组成1 份样品的量荧光 RT-PCR 反应液12.5 l逆转录酶0.5 lTaq 酶0.5 l引物和探针3lH2O3.5 lc. 加样：将提取好的样本RNA ，分别加入上述分装好的PCR反应管中，模板量可根据样本情况自行决定（临床标本通常使用5ul 模板量），不够部分以水补足。总反应体积25L。荧光 RT-PCR 循环条件设置程序循环数温度

15、（摄氏度）反应时间（分钟：秒）114230min21952min3409510s6035s60时收集荧光信号结果分析条件设定和结果判断阴性对照：核酸提取时以灭菌双蒸水代替标本。阳性对照：提取好的阳性核酸作为模板RNA 。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准，或可根据仪器噪音情况进行调整。Ct 值35.0的样本为阳性。Ct 值无数值的标本和Ct 值38.0的样本为阴性样本。38.0 Ct 值35.0 的样本为临界值。注：荧光 PCR 同时读取 FAM 和HEX ，进行双通道检测， FAM 荧光 Ct 值为 CVA 16 的结果， HEX 荧光 Ct 值为 E

16、V 71 的结果。四、生物安全根据 2006 年1 月11 日卫生部制定的人间传染的病原微生物名录，柯萨奇病毒、埃可病毒、 EV71 型和目前分类未定的其他肠道病毒均属于危害程度第三类的病原微生物。 因此在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全 II 级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。操作粪便、脑脊液和血液等临床标本时要特别注意生物安全， 要在 II 级生物安全柜中进行标本处理、 病毒分离和病毒鉴定，无脊灰疫苗免疫史的人员要进行脊灰疫苗免疫。灭活后的血清抗体检测与 PCR 检测可在生物安全 I 级实验室进行。所有操作应遵守国家相关法律法规。附表： 1手足口病病例临床标本采样登记表2手足口病病例临床标本检测结果登记表