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1、期刊文献胃转安方治疗胃癌前病变大鼠的端粒酶活性的影响以及安全性的研究刘华一1 陈 伟2 王 蓉1 王秀娟1 江海涛31天津市中医药研究院附属医院 2天津中医药大学 3天津中医药大学附属第二医院中图分类号：R735.2 文献标识码：A 文章编号：18180086（2009）03摘 要： 目的 观察胃转安方对胃癌前病变大鼠胃组织以及正常组织骨髓和睾丸的端粒酶活性的影响，进一步深入探讨中药治疗胃癌前病变的作用机理，以及胃转安方在长期的服用过程中可能存在的不良反应，为临床治疗提供科学的理论依据。方法 采用N-甲基-N硝基-N亚硝基胍（MNNG）诱导的综合造模法，建立PLGC大鼠模型，并设立正常对照组，
2、自然恢复组，中药胃转安治疗组，西药AZT治疗组四组。实验结束后，采用TRAP-银染法检测各组大鼠胃组织，睾丸和骨髓组织中端粒酶的活性，并相互比较。结果 与其它组比较，自然恢复组大鼠胃组织中端粒酶被激活有显著差异，p0.05；中药治疗组与西药治疗组比较，端粒酶活性表达，无显著性差异，p0.05；自然恢复组、中药治疗组、西药治疗组大鼠，睾丸组织和骨髓组织中端粒酶活性与正常对照组相比，均无显著性差异，p0.05。结论 胃转安方有效抑制胃粘膜异型增生，抑制端粒酶活性，阻止癌前病变向胃癌的转变，且对正常组织中端粒酶活性无影响，提示胃转安方治疗胃癌前病变安全可靠。关键词：胃转安方；胃癌前病变；端粒酶；安全
3、性 胃转安方是临床治疗慢性萎缩性胃炎胃癌前病变的专方，疗效显著。我们前期的实验已证实，在MNNG攻击制作大鼠胃癌前病变的过程中，大鼠胃组织的端粒酶活性被激活了，并且中药胃转安方能有效地抑制胃癌前病变大鼠胃组织端粒酶的活性1。然而，研究表明除恶性肿瘤细胞有端粒酶活性表达外, 正常组织如：生殖细胞、造血干细胞、外周血白细胞、表皮细胞等具有再生能力的细胞也有不同水平的端粒酶活性表达2, 有报道称端粒酶抑制剂对正常组织中端粒酶的活性无影响，但有学者对此持否定态度，并用实验证实了自己的观点3。此研究将观察胃转安方对胃癌前病变大鼠胃组织端粒酶活性的抑制作用的实验，能否被重复，胃转安方对胃癌前病变大鼠睾丸组
4、织和骨髓组织中端粒酶活性是否有影响。从而探讨中药治疗胃癌前期病变可能的作用机理以及在长期服药过程中可能出现的不良反应。1实验材料1.1实验动物 SPF级Wistar大鼠70只，雄性，体重在80-100克，由北京维通利华公司提供。合格证号：0078597。1.2试剂 N-甲基-N硝基-N亚硝基胍（MNNG），日本东京化成工业株氏会社；胃转安方药膏（方由黄芪，虎杖，莪术，红大戟，半枝莲，山慈姑，甘草等组成）由天津市中医药研究院附属医院提供；叠氮胸苷（齐多夫定片，AZT），东北制药总厂；TRAP-银染法端粒酶活性检测试剂盒，购自南京凯基生物科技发展有限公司；考马斯亮蓝G -250，美国 Sigma
5、公司；内标引物，分子量为307bp，序列为：上游引物 5-CCCAA TCCGT CGAGC AGAGT TTGCC TTACT GGTTA GC，下游引物 5-GCCGA CCCTA ACCCT AACCC TAACG GACCA GAGAA AAATC AC ；由天津灏洋生物公司设计。1.3 所用仪器 光学显微镜，Olympus CX 31型，日本；紫外可见分光光度计，754型，上海光谱仪器有限公司产品；PCR扩增仪，TC-96/T/H（a），杭州博日科技有限公司；台式离心机，TGL -16B，上海安亭科学仪器厂；电泳仪，DYY-7C，北京市六一仪器厂。2动物造模 将70只大鼠适应性喂养一
6、周后，根据体重随机抽取12只作为正常对照组，剩余58只鼠进行造模。动物造模方法参照王少明等4造模方法，将MNNG 配制成1g/L的母液，4。C避光保存，每周配制一次，使用时将其稀释成100ug/ml的溶液，加入到涂有黑漆的瓶子里让造模组大鼠自由饮用，同时喂食含有0.03%的雷尼替丁，并采用饥饱失常喂养法，即进食2天，禁食1天，禁食当天下午用40%的乙醇灌胃，2ml/只，乙醇灌胃共10周 。26周、30周时分别随机处死正常组鼠1只和造模组鼠3只，做病理组织学检查，HE 染色，光学显微镜下观察鼠胃粘膜的变化，以确认模型是否成功。正常组普通喂养。 造模过程中大鼠死亡9只，30周造模成功后，将造模组大
7、鼠按体重随机分为自然恢复组11只，中药治疗组16只，西药治疗组16只。自然恢复组普通喂养，中药组大鼠喂食加有胃转安药膏的饲料（按每只大鼠每日相当于成人体重给药量的20 倍计算，将中药药膏掺入饲料），西药治疗组大鼠除普通喂养外，每只鼠每天灌胃AZT 100mg/kg进行治疗。42周时，各组鼠禁食1天后，全部处死，取材，剖腹取大鼠胃组织，沿胃大弯剪开后，生理盐水洗净，观察胃粘膜情况，再沿胃小弯将胃剪成两半，右侧一半展平，用滤纸两面固定后，放入福尔马林液中固定（HE染色，光镜观察结果），左侧一半放入液氮中速冻；剥离睾丸组织，留取左侧，液氮速冻；分离两侧股骨，去掉骨两端，用预冷的生理盐水冲出骨髓组织，
8、离心机3000rpm, 离心15min后，弃上清，将沉淀放入冻藏管中液氮速冻。然后将液氮中标本转入 -80 oC冰箱保存。3端粒酶活性检测3.1端粒酶的提取 根据试剂盒提供方法提取端粒酶，主要步骤如下：称取胃组织，睾丸组织0.5克，PBS洗涤后研碎，骨髓组织直接研碎。胃和睾丸中加入200ml wash buffer，40ul lysis buffer, 骨髓组织中加入10ul 冰冷的wash buffer, 4ul 冰冷的lysis buffer；悬浮沉淀，放置冰上半小时后，13000rpm，离心30min，取上清，Ependoff管分装，-20。C保存备用。其中一管用考马斯亮蓝G-250法测
9、蛋白浓度。为保证端粒酶活性，提取所用的枪头用DEPC水浸泡24小时后，再进行高压灭菌，烤干；取样品所用的玻璃制品、陶瓷品及手术器械等经烤箱170 oC烘烤5个小时。操作过程中尽量保持低温。3.2 PCR扩增 吸取5ul 10TRAP buffer，另加入1ul dNTPs，1ul Taq-DNA polymerase， 1ul TS primer，2ul端粒酶提取物，然后加入39ul 灭菌超纯水，于PCR 扩增仪上23 oC 保温10min；然后加入1ul CX primer，混匀，在扩增仪上进32个循环，循环参数93 oC，35s；60 oC，30s；72 oC，50s；最后72 oC 延伸
10、8min。将内标引物进行扩增，扩增条件同端粒酶提取物。3.3 电泳及染色 取9ul PCR 产物加上1ul 10上样缓冲液，并加入2ul 扩增的内标引物。在电压180V，10非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳2小时。凝胶固定过夜后，银染显色，拍照记录结果，并用凝胶成像分析系统分析结果：分析系统出现三个波峰以上者定为端粒酶活性为阳性，并记录各组端粒酶条带形成波峰面积之和与内标条带形成波峰面积的比值，进行统计学分析。3.4 统计方法 结果以均数加减标准差（s）表示，统计方法采用SPSS 13.0 软件，计量资料作单因素方差分析（analysis of one-way，ANOVA），计数资料做X2 （ch
11、i square test） 检验。4实验结果4.1 光镜观察 与正常组比较，自然恢复组大鼠胃腺上皮增生明显，粘膜基底部可见大量新生腺上皮细胞，细胞核、染色质着色较深，核浆比例增大，出现背靠背现象，腺体排列紊乱，组织结构，细胞形态均可见异型性。中药组大鼠胃粘膜腺上皮增生较自然恢复组明显减轻，基底部腺上皮细胞核着色与正常对照组近似且排列有序，管腔大小较一致，核浆比例均分。西药组大鼠腺上皮增生和形态改变较自然恢复组略有减轻，但比正常对照组和中药治疗组大鼠增生较重。4.2 端粒酶活性检测结果 自然恢复组大鼠胃组织端粒酶活性被激活，与正常对照组、西药治疗组、中药治疗组相比，有明显差异，p0.05；中药
12、治疗组和西药治疗组均能有效抑制端粒酶活性，与正常对照组比较无差异，p0.05；中药治疗组和西药治疗组对端粒酶的抑制作用无差异，p0.05。见表1表1 各组鼠胃组织端粒酶活性（附图）组别例数（只）端粒酶活性比值阳性阴性正常对照组100100.58500.2022自然恢复组1174*0.98640.4627西药治疗组162140.60560.2758中药治疗组163130.61250.3059注：*与其它三组 p0.05 与、 p0.05 与 p0.05 与、 p0.05 各组大鼠睾丸组织中端粒酶活性无差异，p0.05。因此认为胃转安和叠氮胸苷对大鼠睾丸组织端粒酶活性无影响。表2各组鼠睾丸组织端粒
13、酶活性（附图）组别例数（只）端粒酶活性比值阳性阴性正常对照组101001.61140.3304自然恢复组111101.78780.6890西药治疗组161601.42550.4828中药治疗组161601.67600.4788各组之间相互比较，均p0.05 各组大鼠骨髓组织中端粒酶活性无差异，p0.05。因此认为胃转安和叠氮胸苷对大鼠骨髓组织端粒酶活性无影响。表3各组鼠骨髓组织端粒酶活性（附图）组别例数（只）端粒酶活性比值阳性阴性正常对照组101001.14780.2192自然恢复组11920.93200.3186西药治疗组161150.92160.4967中药治疗组161420.94660.
14、3787各组之间相互比较，均p0.055 讨 论在全世界，胃癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤的第二位，严重威胁着人类的健康。而胃癌前病变（Precancerous lesions of gastric cancer，PLGC）的研究是胃癌防治研究的重点。当前，西医学对PLGC 的治疗尚缺乏理想的方法，中医药对该病的治疗则有一定的优势，取得了良好的疗效，大量的临床治疗及实验研究都表明中医药对PLGC具有明显的预防和逆转作用。尤其是实验研究的深入，逐渐揭示了中医药治疗该病的机理。经过多年的临床及流行病学调查，将该病的病因病机总结为“因滞致虚，因虚夹邪”，在此基础上研制出胃转安方，方中黄芪，党参等补脾胃
15、之虚；丹参，莪术等活血化瘀，改善胃粘膜的血流情况；半枝莲，山慈菇，清热解毒。诸药皆能对抗肿瘤，合用则共奏攻毒祛瘀补虚之效，达到治疗胃癌前病变的目的。临床运用，疗效显著，能有效抑制和逆转胃癌前期病变。近年来，端粒酶与细胞永生化关系的确立，使得端粒酶成为肿瘤分子病理学研究的一个热点。国内外有大量研究资料表明：在肿瘤发生的多阶段、多步骤过程中，端粒酶的再激活可能参与细胞的癌变过程，端粒酶几乎在所有类型的肿瘤中均有不同程度的表达，端粒酶已被公认为目前已知的最为广谱的肿瘤标志物之一5。而且端粒酶的活性不仅在胃癌组织中有较高的阳性表达率，在胃癌的癌前病变中也已经有所表达6，且端粒酶活性随胃癌癌前病变的恶性
16、程度增加而增加，因此其对胃癌发生的预测和治疗都具有重要的意义，针对端粒酶基因的调控，可以通过抑制端粒酶的活性，来抑制肿瘤的生长并促进其凋亡，具有对肿瘤细胞特异性的作用，是肿瘤靶向治疗的一个新的研究方向。实验中发现胃转安方能显著降低端粒酶的活性(p0.05)，从而阻断胃癌前病变向胃癌的发展，有效治疗PLGC，但对正常组织睾丸和骨髓中端粒酶的活性没有影响（p0.05）。端粒酶活性抑制剂AZT降低端粒酶的活性(p0.05)的同时对正常组织睾丸中端粒酶活性无影响，尚不认为对骨髓中端粒酶活性有影响。对于自然恢复组、西药治疗组、中药治疗组中骨髓组织端粒酶表达阴性的，考虑骨髓组织样品量不足，其中端粒酶含量过
17、少，因此未能检测出活性。但西药治疗组中骨髓组织端粒酶阴性表达例数较多，西药对骨髓中端粒酶活性的影响有待进一步研究。AZT虽然能抑制端粒酶活性，但对胃粘膜的逆转作用有限，推测AZT能抑制PLGC向胃癌转变，但对PLGC临床症状的改善有限。端粒酶及其各组分是较理想的肿瘤治疗靶标，由于肿瘤特异性，针对端粒酶的基因治疗可能避免传统放、化疗剂量、效果与毒副作用之间的矛盾，已成为肿瘤治疗新方向。中药具有副作用较小的优势，针对端粒酶为靶点的中医药治疗胃癌前病变的研究，将有广阔的前景。 参考文献：1 刘华一，王蓉，王秀娟，等，胃转安方对胃癌前期病变大鼠端粒酶活性干预作用的实验研究J，中医药学刊，2004，22
18、(7)：12531254.2 滕晓华，徐如祥，黄涛等，不同年龄大鼠组织端粒酶活性变化的研究J，中华神经医学杂志，2005，4(6)：560562.3 阮晓峰，薛明慧，周云峰，端粒酶抑制剂联合辐射对小鼠骨髓造血的抑制作用J，中国实验血液学杂志，2003，11(4)：363367.4 王少明，林才经，杨春波等，大鼠胃粘膜癌前病变试验动物模型的建立J，药学实践杂志，2005，23(5)：271-272.5 钟英强，端粒酶与肿瘤J，国外医学内科学分册，2001，28(10) : 347.6 王卫政，何长华，魏晓峰等胃癌及癌前期病变中端粒酶活性及临床意义，中国医师杂志J，2006，8(1)：99100.
胃转安方治疗胃癌前病变大鼠的端粒酶活性的影响以及安全性的研究
