马铃薯组织培养

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1、马铃薯组织培养前言：马铃薯组织培养的意义 . 马铃薯（Solanum tuberosum）属茄科茄属植物! 常见的育种途径有: 常规二倍体杂交法,四倍体水平的品种间杂交法,远缘种间杂交法 ,2n配子利用法。这些途径都是通过有性生殖产生马铃薯变异体，通过系谱，回交，轮回选择的方法，需经过6-8代选出附合目标性状的新个体。进入 20世纪90年代后，随着生物技术的深入发展，人类对植物细胞遗传行为，基因表达传递行为达到分子水平深入了解，作物育种工作者开始引入了除单纯户外有性杂交育种之外，又一育种方法室内体细胞无性系变异育种法，其中组织培养（tissue culture）诱导再生植株的突变就是最常用的一

2、种。当马铃薯外植体（ 茎尖脱毒分生组织）培养时， 由于组培环境引发了细胞异染色质 DNA延迟复制, 产生了较田间自然突变率高出500倍的大量变异。这一现象已越来越被马铃薯育种工作者所认可，并成为一条马铃薯育种的有效途径。现从组织培养及组织培养在马铃薯育种上的发展历史，研究意义，研究方式以及未来展望等方面逐一论述。马铃薯的市场效益（为什么选马铃薯作试验材料）马铃薯是世界上仅次于小麦、水稻和玉米的第四种主要农作物就单位面积出产的干物质而言，它高于小麦、大麦和玉米，就单位面积出产的蛋白质而言，分别为小麦、水稻和玉米的2.02，1.33和1.20倍。目前我国马铃薯常年种植面积为467万公顷左右，鲜薯年

3、总产量5500万吨，居世界第一位。种植区域主要分布在黑龙江、吉林、内蒙古、山西、甘肃、青海、云南、贵州、四川等广大地区。但是我国的马铃薯加工业发展十分缓慢，基本上以鲜食为主，少部分用于传统食品加工和制取粗淀粉，深加工产品很少，而且加工生产规模小，工艺落后。20世纪90年代国内以马铃薯为原料的食品工业进入了一个蓬勃发展的时期然而产品与外同类产品相比，无论是在色泽、口味、品质，还是在包装上均存在一定差距。马铃薯块茎水分多、脂肪少、单位体积的热量相当低，所含的维生素C是苹果的10倍，B族维生素是苹果的4倍，各种矿物质是苹果的几倍至几十倍不等，土豆是降血压食物膳食中某种营养多了或缺了可致病。近年来随着

4、人民群众生活水平的日益提高，我国的食品结构出现了一些新的变化，中西方的饮食文化开始相互渗透和融合，马铃薯加工食品在我国同样备受欢迎。随着麦当劳、肯德基等洋快餐在我国落户，其中必有一款的炸薯条、薯泥等马铃薯食品很受国内中层消费者的喜爱，尤其是儿童对其情有独钟，成为未来我国马铃薯食品潜在的庞大的消费群体。1 马铃薯的生态习性和种类马铃薯生长对土壤的适应性很强，但对气候要求凉、冷、燥，在湿热地区虽然也能生长，不过一代以后品种就会演化，需要经常从寒冷地区引进新的种。种薯在土温58的条件下即可萌发生长，最适温度为1520。适于植株茎叶生长和开花的气温为1622。夜间最适于块茎形成的气温为1013（土温1

5、618），高于20时则形成缓慢。出土和幼苗期在气温降至-2即遭冻害。开花和块茎形成期为全生育期中需水量最大的时期。马铃薯在原产地就有几百个品种，在世界各地又不断地培养新品种，目前全世界有几千个品种，有含淀粉比例较高，适合作为主食的，也有适合作为蔬菜食用的。人们根据不同的用途培养出很多新品种，花色有白色、红色、紫色等品种，地下块茎有圆形、卵形和椭圆形，其皮色有红色、黄色、白色和紫色的不同品种。一般用块茎上的“芽眼”切下播种，如果用种子种植，很快就会产生变异，因此非常容易出现新品种。2 马铃薯茎尖的组织培养植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌的条件下，将离体的植物（根

6、、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。由于培养物是脱离植物母体，在玻璃瓶中进行培养，所以也叫做离体培养。在有些情况下，再分化也可不经愈伤组织阶段，而直接发生于脱分化的细胞1。植物组织培养是20世纪初发展起来的一门新兴技术,随着这项技术的日益完善,其应用也越来越广泛,可用于种苗快繁、植物脱毒、植物育种、种质资源保存以及次生代谢物提取等方面。尤其植物快繁和脱毒是应用最多和最广的方面,而且许多花卉苗木的试管育苗已进入了商品化生产2。马铃薯薯块及芽外植体消毒灭菌后在M

7、S基本培养基中培养效果最好3。黄萍等认为在马铃薯初代培养基(作茎尖培养用)和增殖培养基(作试管苗快速繁殖用)中分别加入25g/ml链霉素、四环素和苯甲酸钠3种抗污染剂,结果发现:苯甲酸钠在初代培养基中抑菌效果最好;而在增殖培养基中以四环素的抑菌效果最佳。4植物组织中普遍存在内生菌,当植物组织进行离体培养时,这些内生菌就会产生污染5。为了消除植物组织培养过程中出现的真菌和细菌污染 ,而又不杀伤植物组织 ,采用多菌灵和青霉素混合溶液浸泡污染的组培苗茎段的结果发现 ,多菌灵对真菌有杀灭作用 ,对细菌没有明显作用 ;青霉素只对细菌有抑制作用 ,继代后细菌污染照常存在 ;而对污染的组培苗采用 75 %乙

8、醇和 0 .1% HgCl2 处理可彻底杀灭真菌和细菌6。3 植物激素对马铃薯生长的影响试验以品种为主区,激素处理为副区进行裂区设计,研究赤霉素(GA3)与茉莉酸甲酯(MeJA)对雾培马铃薯内源激素与生长发育的影响。结果表明:外源GA3处理增加了3个马铃薯品种叶片内源IAA和JA的含量,降低了中晚熟品种高原7号的内源ABA含量。外源MeJA对马铃薯块茎均有一定诱导作用,但结合GA3处理其诱导结薯的能力会减弱。7马铃薯块茎形成期,脱落酸含量显著增加,赤霉素含量则显著降低,赤霉素与脱落酸比值下降到一定水平是块茎开始形成的重要条件。外加脱落酸喷施叶面,使块茎形成提早,但结薯数并未增加;外加赤霉素喷施

9、叶面,使植株细高,匍匐茎细长,块茎形成显著延迟,块茎数显著减少,这一结果进一步证明了脱落酸和赤霉素在块茎形成中的作用。8研究表明外源添加赤霉素(GA,Gibberellins)能促进马铃薯茎、叶和匍匐茎的生长,而抑制块茎的形成.添加GA生物合成抑制剂可降低植株体内GA水平和活性,促进块茎形成。9在诱导结薯的过程中给以不同浓度的香豆素处理 ,研究香豆素对试管微型薯诱导的影响。结果表明 ,在诱导结薯的培养基中 ,添加香豆素处理的浓度为 30mg/L时 ,获得的微型薯块茎较大且大薯率较高。10在加入100mg/l香豆素时,试管结薯的数量与使用500mg/l矮壮素效果相近似。使用50mg/l人参寡糖素

10、或10mg/l黑节草寡糖素时,试管结薯的数量明显超过或略超过用500mg/l矮壮素的效果。IAA与GA互作对马铃薯试管苗生长有积极的促进作用,能够明显提高试管苗的高度,最大增幅可达90.3%,而IAA与BAP互作对试管苗生长有明显抑制作用。IAA与GA互作对试管苗根的形成和生长影响不明显。BAP对试管薯形成有重要作用,而GA与BAP互作能进一步促进试管薯生长,处理4(IAA+GA十BAP)比处理3(IAA+BAP)的试管薯鲜重和直径分别增加163.8%和46.4%11。低浓度的2,4-D有利于红色愈伤组织的花色苷积累,高浓度的2,4-D促进其生长而不利于花色苷的积累;高浓度的6-BA能促进红色

11、愈伤组织中花色苷的积累并诱导白色愈伤组织花色苷的合成,但抑制其生长;卡那霉素能使白色愈伤组织变红并积累花色苷,高浓度的卡那霉素严重抑制愈伤组织的生长并最终变褐死亡;提高蔗糖浓度能促进愈伤组织花色苷的产生和积累,但超过70g/L时抑制生长12。4 马铃薯组织培养的具体实验方案4.1外植体培养从已催出芽（芽长一般24cm）的干净健康马铃薯块茎上掰下芽，用自来水冲洗干净，放入0.10.15%的升汞溶液中浸泡810分钟，在超净工作台上消毒完后，放入无菌水中浸泡6次，每次5分钟，然后接种到MS6BA1.5mg/L（毫克/升）GA30.5mg/LIBA0.5mg/L琼脂8g/L蔗糖30g/L（PH值为5.

12、8）的培养基上，每个培养瓶接种15个外植体。13将接种好的培养皿用封好置于恒温光照箱中进行培养，培养条件为28，每天光照16h，光照强度2 ooo Ix。形成团状的愈伤组织后，继续培养至根、芽分化后，及时移植于三角瓶中培养。144.2茎尖剥离及初代培养外植体培养20天后，在超净工作台上解剖镜下用解剖针将生长点0.10.5mm部分剥离出来，转接到MS肌醇100mg/L+6BA1.5mg/LGA30.5mg/L泛酸钙1.5mg/L蔗糖30g/L琼脂8g/L活性炭0.17g/L（PH值为5.8）的培养基上，每个培养瓶接种45个生长点。光照保持30006000Lux（勒克斯）左右，每天照光1316小时

13、 ，温度控制在23，经26个月左右培养诱导，其间转接23次，生长点即可长成新的小植株。经病毒检测不带病毒的株系就可进行扩繁，未脱毒的株系淘汰。 15 4.3试管苗扩繁4.3.1扩繁前的准备1扩繁培养基的制备。扩繁培养基以MS培养基为扩繁基本培养基，外加6BA0.5mg/L+NAA0.51.5mg/L+蔗糖30g/L琼脂8g/L活性炭0.17g/L，pH值为5.8。2把接种用具在超净工作台上用紫外线灯消毒2030分钟，关掉紫外线灯，打开日光灯和吹风机。3用肥皂把手洗干净并擦干，再用75%酒精消毒，待手上酒精干后，点上酒精灯，把剪子、镊子培养皿等所需用具在酒精灯上进行消毒。4.3.2接种扩繁用75

14、%酒精喷待接的试管苗和制备好待用的扩繁培养基表面，将已脱毒株系按每苗留12片叶为一个茎段剪下，正向插入扩繁培养基（即MS6BA0.5mg/LNAA0.51.5mg/L蔗糖30g/L琼脂8g/L活性炭0.17g/L，PH值为5.8的培养基）上。一般每个培养瓶接种15个茎段，在温度2527,光照20003000Lux，每天1516小时条件下培养34天即可生根长芽。30天后可按1：7瓶进行扩繁一次，即原来每瓶15苗扩繁一次可达7瓶105苗，以后每隔30天扩繁1次，繁殖到目标苗数后，再经23个月培养即可扦插到原原种繁殖网室，进行原原种繁殖16。5 马铃薯组织培养中的污染原因及控制措施1污染的症状和原因

15、真菌性污染主要指霉菌引起的污染。一般接种后38d可在培养基中发现各种颜色的菌斑。真菌性污染，一般是由空气污染和瓶口边缘的灰尘和真菌孢子落人器皿中造成的。另外，在湿度太大的季节和培养室内。棉塞也会长出真菌孢子引起大量污染。细菌性污染是指在培养过程中工作人员使用了未经充分消毒的工具在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或浑浊的水渍状有时呈现泡沫发酵状。一般在接种后12d即可发现。细菌污染又以芽孢杆菌最普遍、最严重。这种芽孢杆菌能耐一定高温、高压，对消毒剂和紫外线也有一定抗性。常由于高压灭菌不彻底造成的。因此，每次培养基灭菌后应放在培养室2-3d。看培养基表面和内部无任何细菌痕迹才能使用。 2

16、在灭菌过程中需注意以下几个环节：锅内灭菌物不能堆放过满，否则将阻碍蒸汽的流通和热交换，使容器内升温减慢造成物体内部杀菌不完全。压力升到O5k：加rn=时打开放汽阀，将锅内冷空气彻底排放干净，防止灭菌不彻底后再关闭放汽阀，使压力稳定。在压力11k小m2、温度为120121。C下持续灭菌1525min，灭菌时间不宜超过30min，以免引起培养基成分变化。据报道对于一些内生细菌可在培养基中加入一定浓度的抗菌素(青霉素Na 120mgL+链霉素40m班)，对其污染可起到一定程度的抑制作用。3 基础苗的表面消毒在接种之前，基础苗需经严格的挑选。仔细观察待转基础苗，清除已被污染的基础苗，确认无污染才能取用

17、。对于一些初期感染的基础苗，由于菌源太小，肉眼不易发现，不确定是否被污染的基础苗也应果断清除。用75酒精擦拭培养瓶的外壁(及瓶盖)，消除附着在瓶外壁上的杂菌后放在超净工作台中，用紫外灯消毒2030min备用。4 接种过程的注意事项接种的基本技术环节是降低污染率的关键措施。在接种中，为了降低污染应注意以下几项事宜：接种室保持干净整洁应定期对接种室用75酒精进行喷雾降尘和熏蒸f甲醛：高锰酸钾=2：1)灭菌4。并定期对接种室进行2025min的紫外灭菌。在每次接种前，用紫外灯光照射、杀菌3035min。接种过程中操作人员应及时用75酒精擦拭双手和超净工作台台面及台壁。接种过程中，瓶子呈斜角，瓶口放在

18、酒精灯火焰上方，利用气流上升的原理，以阻止空气中飘扬的孢子落入瓶内。接种后瓶盖要拧紧、拧严。接种器械应及时在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌。每接一瓶所用器械消毒一次。台面上尽量少放瓶子保证气流畅通。使操作区空气不断净化。注：若长时间使用一种消毒药剂，空气中散落的真、细菌孢子就会产生抵抗不利环境的抗性。所以应该每隔一段时间就更换一种消毒液。如：过氧乙酸。17马铃薯组织培养的前景展望组织培养是一种打破传统的新型繁衍后代方法，能最大效率地利用空间，使高等作物生长发育的微生物化，田间马铃薯育种材料圃种植 45000株/hm2， 在组织培养室每 4cm2培养1株 ,且能多层架放置培养瓶, 加上繁殖周期短, 变

19、异母体材料扩大了500-2000倍。同时由于组织培养条件使染色体突变率的增强，若再增设人工诱导突变剂，提高了变异率，所以组织培养在马铃薯育种是一种很有潜力的方法。从20世纪 90年代至今，随着细胞分子领域的深入，基因 DNA 序列的测定，人类对生命的微生理化，为现代生物技术辅助育种成为可能，至今已有许多作物成功地进行基因转移，表达基因调控，体细胞无性系杂交， 细胞器移植，花粉单倍体培养，单倍体加倍纯合等。而这些辅助育种手段都离不开组织培养，可见，21世纪开展马铃薯及其它作物育种，应用组织培养技术势在必行，前景美好。参考文献 (References)1 曹孜义,刘国民实用植物组织培养技术教程修订

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