铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究

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1、4期 岳 明等：铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究1197铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究岳 明，丁宏标，乔 宇 （中国农业科学院饲料研究所生态饲料研究室，北京 100081）摘要：【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株，以期获得重组海藻酸裂解酶，并对其性质加以研究。【方法】采用PCR的方法，以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因组DNA 为模板，克隆出约1.0kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列，并将其插入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9K中，获得重组质粒pPIC9K-algL。重组

2、质粒线性化后用聚乙二醇（PEG）法导入毕赤酵母菌株GS115中表达。【结果】用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵，表达得到40 kD的目的蛋白，酶活力达540 Uml-1左右。经测定，该重组酶的最适反应pH为8.5，最适反应温度为40，并且在2045，pH 3.012.0具有较好的稳定性。50 mmolL-1的Co2+和Ca2+对酶活力均有显著的促进作用，Zn2+、Cu2+和Fe2+在不同浓度下对酶活力均有不同程度的抑制作用。在重组酶的辅助作用下，抗生素的抑菌效果明显提高。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源海藻酸裂解酶，为其今后在工农业中的应用奠定了基础。 关键词：海藻酸裂解酶；毕赤酵母；海藻寡糖；

3、诱导表达Expression of Pseudomonas aeruginosa Alginate Lyase Gene (algL) in Pichia pastoris and Characterization of the EnzymeYUE Ming, DING Hong-biao, QIAO Yu(Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)Abstract: 【Objective】The purpose was to clone and express algin

4、ate lyase gene (algL) of Pseudomonas aeruginosa in Pichia pastoris expression system. 【Method】Alginate lyase gene of P. aeruginosa was amplified and inserted into pPIC9K expression vector by adding EcoR I site to generate recombinant pPIC9K-algL construct. The positive construct was transformed to P

5、ichia pastoris GS115 cells by PEG method. The AlgL protein was over-produced in P. pastoris induced by methanol. 【Result】 The product of recombinant alginate lyase showed a molecular weight of 40 kD on SDS-PAGE with activity of 540 Uml-1 at an optimal temperature 40 and pH 8.5, respectively. The rec

6、ombinant AlgL was stable below 45 between pH 3.0 and 12.0. The recombinant AlgL was sensitive to some metal cations negatively including Zn2+, Cu2+ and Fe2+, but Co2+ and Ca2+ promoted it dramatically. The sterilization of ampicilin and kanamycin on P. aeruginosa increased with the help of AlgL. 【Co

7、nclusion】P. pastoris expression system is an efficient way of production of AlgL. The recombinant AlgL has potency as feed additive and antibiotic assistant.Key words: Alginate lyase; Pichia pastoris; Alga oligosaccharides; Induction expression 0 引言【研究意义】海藻酸盐（alginate）是广泛存在于大型海藻细胞壁中和某些细菌胞外的黏性多糖。它的存在

8、对以海藻为饲料的动物体内形成了一种抗营养因子，影响了海藻细胞内营养物质的释放，降低了饲料利用率。另外，海藻酸盐有助于致病铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在病灶部位定殖1,2，影响抗生素的扩散和杀菌效果，使铜绿假单胞菌具有较高的抗药性3,4。铜绿假单胞菌在产生海藻酸盐的生理后期能产生一种海藻酸盐裂解酶（alginate lyase，AlgL），可催化海藻酸盐-D-甘露糖醛酸单体间1，4-糖苷键断裂，生成寡聚糖醛酸5,6，降低细菌的黏附能力，从而结束其生命周期。海藻饲料中的海藻酸盐经海藻酸裂解酶降解后，胞内的营养物可被充分质释放出来，利于动物消化吸收，所产生的海藻寡糖还

9、具有改善动物胃肠道微生态环境等活性。因此，海藻酸裂解酶的生产研究对饲料资源与医药开发具有一定的理论与现实意义。【前人研究进展】一些微生物79和海洋动植物1013都可以产生海藻酸裂解酶，早期海藻酸裂解酶主要由天然菌株培养提取5,14。随着基因工程技术的发展，一些物种海藻酸裂解酶基因被克隆和表达1517。Boyd等18和Neal等19先后于1993年首次克隆了铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶的编码基因algL并在大肠杆菌（Escherichia coli）中进行了表达，证明了它与其它海藻酸代谢相关基因（algD-8-44-K- E-G-X-L-I-J-F-A）位于染色体上同一基因簇中，在海藻酸代谢过程中起

10、重要作用20。【本研究切入点】原始菌株产酶量非常有限，提取纯化成本高昂，而在大肠杆菌中表达海藻酸裂解酶基因，易受原核表达系统自身局限性的限制，影响产量与活性。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种分泌型真核表达系统，表达水平高，纯化过程简单，生产成本低21,22，可作为一种高效生产海藻酸裂解酶的手段。【拟解决的关键问题】本研究利用基因工程技术克隆了铜绿假单胞菌algL基因，将其导入巴斯德毕赤酵母并进行诱导表达，旨在获得一种高效生产海藻酸裂解酶的新途径，进而对表达产物性质以及作为抗生素辅助剂的作用效果进行探究。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌株和质粒 铜绿假单胞菌（

11、P. aeruginosa），购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心（CGMCC 1.1785）；大肠杆菌（E. coli）DH5菌株由本室保存；毕赤酵母（P. Pastoris）GS115和pPIC9K分泌型表达载体购自Invitrogen公司；质粒pGEM-T Vector购自Promega公司。1.1.2 酶和试剂 限制性内切酶、T4 DNA、X-Gal连接酶为TaKaRa公司产品； DNA聚合酶购自Tiangen公司； G418购自Invitrogen公司；海藻酸钠、葡萄糖醛酸为Sigma公司产品；氨苄青霉素和卡那霉素为Amresco产品；其它化学试剂为国产和进口分析纯试剂。1.1.3

12、 培养基 LB 培养基见文献23，YPD、RDB、MM、MD、BMGY、BMMY培养基见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。1.2 试验方法1.2.1 铜绿假单胞菌algL基因成熟蛋白编码序列的克隆 参照文献23方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA。根据GenBank No. U27829序列18，以algL基因信号肽编码序列后第一个核苷酸到全基因终止密码子序列（1 023 bp）设计PCR扩增引物，上游引物序列为5 CGAATTCGCCGACCT GGTACCCCCGCC CGGCTACTA 3，下游引物序列为5 CGAATTCGCC CGCTTCCCGCCACGCCCTCAAC TT

13、C 3，其中上、下游引物中都引入EcoR 限制性酶切位点（如下划线所示）。以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，体系为50 l：含有约50 ng铜绿假单胞菌基因组DNA 1.5 l，总浓度10 mmolL-1 dNTP 4 l，10 mmolL-1的上下游引物各1 l，10PCR反应缓冲液5 l，5 Ul-1 pfu DNA聚合酶0.5 l，ddH2O 37 l。反应条件为：94预变性5 min后，94变性50 s，58退火50 s，72延伸1 min，进行30个循环，最后延伸5 min，反应结束后加入Taq DNA聚合酶与dATP 72反应20 min，以使平末端带有成为A突出的

14、黏性末端。 PCR扩增产物经胶回收纯化后，连接到pGEM-T Vector上，转化大肠杆菌DH5a，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，并进行测序鉴定。1.2.2 毕赤酵母重组表达载体的构建 鉴定正确的pGEM-algL经EcoR酶切处理，将切下的algL基因成熟蛋白编码序列插入同样酶切处理的毕赤酵母表达载体pPIC9K中，使其位于-因子信号肽序列的下游，利用PCR鉴定出正向插入的克隆，并对该质粒进行进一步限制性酶切及测序鉴定。1.2.3 毕赤酵母的聚乙二醇（PEG）法转化 接毕赤酵母菌株GS115单菌落于10 ml YPD中30，250300 r/min培养至OD600为0.61.0，离心收集菌体，

15、用10 ml Solution （见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册）重悬细胞，离心收集菌体，用1 ml Solution 重悬细胞，此时酵母细胞处于感受态，取80 l上述菌液，加入3 g经限制性内切酶Bgl线性化的重组质粒pPIC9K-algL，加入1 ml Solution ，充分混匀，30水浴1 h，其中每15 min旋涡震荡，42水浴10 min，4 000 r/min离心收集菌体，加入1 ml Solution ，离心去上清，最后加入100150 l Solution ，重悬细胞，菌液涂布于固体RDB平板上，30培养24 d直至转化子出现。1.2.4 重组毕赤酵母的筛选和鉴定

16、 用灭菌牙签挑取RDB平板上的转化子分别点种到MM、MD和含600 gml-1 G418的YPD平板上，30培养。在MD上生长正常而在MM上生长缓慢或不生长的转化子为甲醇利用慢型；在含G418的YPD平板上生长正常的为多拷贝转化子。毕赤酵母基因组DNA的提取参照Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。以毕赤酵母基因组DNA为模板，利用目的基因特异性引物（序列见1.2.1）进行PCR反应，以确定外源基因的整合情况。1.2.5 重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测 将转化子接种于含3 ml BMGY培养基中的12 ml离心管中，30 220 r/min摇床培养48 h。离心收集菌体，用3 ml

17、BMMY诱导培养基重悬菌体，30220 r/min继续培养，每24 h补加甲醇至终浓度1.0%。每24 h取样，将培养液于6 000 r/min离心5 min，收集上清酶液，用于初步定性测定酶活力，以确定产酶菌株。将产酶菌株重新接种于50 ml培养基中用于性质研究和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析24。采用3，5-二硝基水杨酸法测定酶活力25。每24 h取甲醇诱导的产酶菌株酶液100 l与100 l 1%褐藻酸钠溶液（pH 7. 0的1/15N的磷酸缓冲液配制）于试管中混匀，同时以100 l 蒸馏水替代酶液做空白对照试验。置于40水浴反应10 min，冷却，加入3，5-二硝基水杨酸显色剂600

18、l，再沸水浴10 min显色，冷却，用蒸馏水定容至5 ml，混匀，在550 nm下测定吸光度（用空白调零），OD值越高酶活力越高。酶活力定义：在一定温度和pH值下，每分钟催化海藻酸钠水解生成1 g葡糖醛酸的酶量定义为一个海藻酸裂解酶活力单位（U）。1.2.6 重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测定 表达产物经Millipore离心过滤脱盐后，在40不同pH条件下测定重组海藻酸裂解酶的活力；将重组海藻酸裂解酶液在不同pH值的缓冲液中40保温30 min，检测剩余的酶活力（以最适反应pH下酶活力为100%）。将表达产物在pH 8.0不同温度下测定重组海藻酸裂解酶的酶活力；将重组海藻酸裂解酶液在p

19、H 8.0不同温度下分别保温30 min，检测剩余的酶活力（以最适反应温度下酶活力为100%）。配制0.1 molL-1的CoCl26H2O、MnSO4H2O、CaCl2、KCl、NaCl、CuSO4、FeSO47H2O、ZnCl2、MgSO4溶液，将酶液与上述溶液混合（使终浓度分别为1、10和50 mmolL-1）后在40保温30 min，测定酶活力，以未与盐溶液混合，在40保温30 min的酶液活力为100%。1.2.7 重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析与对铜绿假单胞菌耐药性的影响 将1 ml 1%的海藻酸钠底物与500 l酶液混和，在40下保温6 h，使之充分反应。将反应混和物煮沸灭活

20、后，在展开剂（正丁 醇甲酸水461）中进行薄层层析，凉干后，均匀喷上显色剂（甲醇硫酸41），100显色5 min。将重组酶、抗生素分别或混和（使抗生素终浓度相同）点于铜绿假单胞菌生长平板（含OD6000.6菌液100 l）上，对比氨苄青霉素和卡那霉素的抑菌效果变化26。2 结果与分析2.1 铜绿假单胞菌algL基因成熟蛋白编码序列的克隆及毕赤酵母表达载体的构建以铜绿假单胞菌基因组DNA为模板，扩增出1.0 kb左右的 algL基因成熟蛋白编码序列，插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中后，测序结果表明插入片段在pPIC9K中有正确的阅读框，表达载体pPIC9K-algL构建成功。2.2 重组毕赤

21、酵母的筛选和鉴定通过在MM和MD培养基上的培养，得到的转化子大部分为甲醇利用慢型，并在含有600 gml-1 G418的YPD平板上获得了多个高拷贝转化子。提取重组工程菌菌株基因组DNA，进行PCR鉴定，结果表明algL基因成熟蛋白编码序列已插入到毕赤酵母的基因组中（图1），保证了基因的稳定遗传。2.3 重组海藻酸裂解酶的诱导表达与活力检测将初筛有酶活的菌株在诱导培养基中进行表达，每24 h测酶活力，筛选出一株酶活力最高的毕赤酵母重组工程菌，酶的活力在诱导培养120144 h达到高峰（达O in 力较nNG图2），峰值为540 Uml-1左右。SDS-PAGE分析结果表明（图3），表达产物分子

22、量约为40 kD。2.4 重组海藻酸裂解酶最适反应条件及稳定性测定在不同pH反应条件下测定重组海藻酸裂解酶的活力，测得该酶最适pH为8.5左右，并在pH 4.012.0的条件下仍具有60%以上的酶活力。将重组海藻酸裂1. 重组酵母基因组PCR扩增产物；2. DL2000分子量标准；3. 原始酵母菌株GS115基因组PCR扩增产物1. PCR product of recombinant P. pastoris; 2. DL2000 marker; 3. PCR product of P. pastoris GS115图1 重组毕赤酵母工程菌株的PCR鉴定Fig. 1 Identifation

23、of recombinant P. pastoris by PCR图2 重组毕赤酵母诱导产酶曲线Fig. 2 Curve of recombinant AlgL activity produced by P. pastoris1-6. 甲醇诱导24, 48, 72, 96, 120和 144小时重组AlgL产物; 7. 蛋白质分子量标准; 8. 诱导前上清液1-6. Recombinant AlgL induced within 24, 48, 72, 96, 120, 144 h by methanol; 7. Standard protein molecular weight; 8. Su

24、pernatant before induction图3 不同诱导时间重组海藻酸裂解酶表达量Fig. 3 SDS-PAGE of expressed AlgL within different induction times解酶在不同pH的磷酸缓冲液中40保温30 min，检测剩余的酶活力，发现该酶在pH 3.012.0的条件下保温30 min后仍剩余60%以上的酶活力（图4）。图4 pH对重组酶活力的影响及pH稳定性Fig. 4 Optimum pH and pH stability of the recombinant AlgL在不同温度条件下测定海藻酸裂解酶的活力，发现该酶最适反应温度为

25、40。将重组海藻酸裂解酶的酶液分别在不同温度下保温30 min，检测剩余的酶活力，结果表明重组海藻酸裂解酶在2045的条件下保温30 min后仍具有75%以上的酶活力，而在50及以上条件下保温30 min酶活下降明显（图5）。图5 温度对重组酶活力的影响和热稳定性Fig. 5 Optimum temperature and thermolstability of recombinant AlgL由图6可见，离子浓度为1、10和50 mmolL-1的盐溶液对酶活力的影响有明显差异：50 mmolL-1的Mn2+、Mg2+、Co2+、Ca2+、K+和Na+对酶活力均有不同程度的促进作用，而在1和1

26、0 mmolL-1浓度下作用不明显，其中50 mmolL-1 的Co2+和Ca2+可将酶活力提高50%以上；Zn2+、Cu2+和Fe2+对酶活力均有抑制作用，而且浓度越高越明显，其中50 mmolL-1的Cu2+与Fe2+分别使酶活力丧失了近80%和60%。图6 金属离子对重组海藻酸裂解酶活性的影响Fig. 6 Effect of metallic ions on recombinant AlgL activity2.5 重组海藻酸裂解酶酶解产物分析及对铜绿假单胞菌耐药性的影响海藻酸钠经重组海藻酸裂解酶降解，可产生多种寡糖，其中包括单糖及其它一系列寡糖（图7），由于单糖和其它寡糖的同时产生说明

27、该酶具有外切和内切活性。1. 葡萄糖醛酸；2，3. 重组酶降解海藻酸钠产物1. Glucuronic acid; 2, 3. Poduction catalyzed by recombinant AlgL 图7 重组海藻酸裂解酶酶解产物TLC分析Fig. 7 TLC of production catalyzed by recombinant AlgL在铜绿假单胞菌生长平板上，根据抑菌圈直径大小，终浓度分别为20 mgml-1和2 mgml-1的氨苄青霉素和卡那霉素与重组酶的混合物的抗菌效果分别提高29%和18%，纯酶液不产生抑菌圈（图8）。a 1. 氨苄西林；2. 重组海藻酸裂解酶与氨苄西林

28、混合物；3. 重组海藻酸裂解酶b 2. 卡那霉素；2. 重组海藻酸裂解酶与卡那霉素混合物；3. 重组海藻酸裂解酶a 1. Ampicilin; 2. Blending of ampicilin and recombinant AlgL; 3. Rcombinant AlgLb 1. Kanamycin; 2. Blending of kanamycin and recombinant AlgL; 3. Rcombinant AlgL图8 重组海藻酸裂解酶对抗生素抗菌效果的影响Fig. 8 Effect of ampicilin and kanamycin with recombinant Al

29、gL on Pseudomonas aeruginosa3 讨论本试验克隆的是铜绿假单胞菌海藻酸裂解酶algL基因成熟蛋白编码序列，利用DAMAN软件与GenBank中algL基因序列进行比对，分别与No. U27829和L14597序列具有99.71%和99.12的一致性18,19。SDS-PAGE分析结果显示，表达产物分子量约为40kD，与文献报道的天然酶基本一致18。重组海藻酸裂解酶活力达540 Uml-1左右，远高于近期袁兆慧等报道的活力水平24。本研究利用分泌型毕赤酵母表达系统，可获得较纯的目的蛋白，基本可以排除酵母自身产生蛋白的影响。另外，通过对重组海藻酸裂解酶酶学性质的初步研究，

30、发现该酶的最适反应温度为40，最适pH为8.5左右，均高于Alfred报道 5，可能与毕赤酵母表达产物的糖基化有关，并且保证了该重组酶在较宽的pH范围下具较高活性和稳定性。本研究中抗生素在重组海藻酸裂解酶辅助作用下，抑菌效果明显提高，这与Richard等使用天然酶所得到的结果相近26，说明重组海藻酸裂解酶能够破坏铜绿假单胞菌细胞的保护层，使抗生素较易进入细菌细胞发挥杀灭作用，降低了细菌的抗药性与药物施用剂量。不同生物来源的海藻酸裂解酶具不同的底物专一性，本试验以多聚甘露糖醛酸（M）海藻酸钠作为酶解底物，但在对不同具体天然底物作用时，可能会产生不同结构与功能活性的的海藻寡糖：有些海藻寡糖可以用作

31、养殖动物和鱼虾的能量饲料和黏结剂，还是一些植物的免疫刺激因子，可刺激小麦等作物免受真菌危害，在欧洲已经被用于防治小麦的白粉病、青枯病等。鉴于自然界中海藻酸裂解酶与其降解产物的多样性27，尚需进一步对不同生物来源具有不同酶学特性的海藻酸裂解酶及酶解产物以深入研究。海藻是世界上最为丰富的海洋植物资源之一，由于人口增多、水资源紧缺、耕地减少，粮食和饲料等优质生物资源需求缺口增大，世界大国日益关注可再生的海洋生物质，日本美国等均投入巨资进行海洋藻类的开发利用研究，“海洋经济”、“生物质经济”已经成为世界性新课题。中国具有占世界30%的海藻产量，因此，利用基因工程技术，采用酵母生物反应器高效表达海藻酸裂

32、解酶，将海藻转化为优质饲料原料，对开发海洋生物质，缓解陆地生物资源紧张，具有重大的社会、科学和经济意义。4 结论利用巴斯德毕赤酵母，高效分泌表达了具有较高活性的海藻酸裂解酶；另外，通过对重组海藻酸裂解酶耐酸碱和耐热性质的研究, 为其在食品, 饲料等工农业领域的应用提供了依据； 加之其具有提高抗生素杀灭致病菌的作用，也扩展了该重组酶在医药等其它领域的应用。References1Arnold S B, Susan P, Marcelo C R, Cynthia C N, Fereshteh E, Neal L S. Effects of alginase on the natural histor

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