米糠多糖的提取研究

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1、 米糠多糖的提取研究 米糠多糖（Rice Brain polysaccharide，RBP）存在于稻谷的颖果皮层里，主要是指分子量不等的一类非淀粉多糖。采用不同的提取工艺会得到不同的米糠多糖组分。米糠多糖具有广泛的生理活性，在抗肿瘤，增强免疫力，降血糖，降脂方面有显著效果。多糖提取的方法有微波浸提法，热水蒸煮法，超声浸提法等。实验中比较了不同去除杂质方法对所得米糠多糖含量的比较，同时也对3种多糖提取方法在米糠多糖的提取中所得的多糖含量进行了比较。选取较优的微波提取法，并对其提取工艺参数进行了进一步优化。1. 米糠多糖的提取1.1 实验材料米糠：无锡秦良商贸有限公司耐高温-淀粉酶：无锡酶制剂厂，

2、20000IU/g试剂：无水乙醇、石油醚、三氯乙酸、盐酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。1.2仪器722型可见光分光光度计；LD4-2A型台式离心机；Panasonic微波炉；真空冷冻干燥机。1.3实验方法1.3.1 米糠样品的前处理将米糠用石油醚按1：3比例脱脂1小时，重复3次，自然干燥。1.3.2 用改进的硫酸-苯酚法测米糠多糖含量1.3.2.1 显色剂的制备将50 mL浓硫酸缓缓加入10 mL水中，冷却至室温，加入0.6 g苯酚晶体搅拌使其溶解配成显色液。1.3.2.2 硫酸-苯酚法测米糠多糖含量取1.00 mL稀释一定倍数的糖液于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀；取1.

3、00 mL蒸馏水于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀，得到参比溶液。将标准溶液和参比溶液置于沸水浴中保温3035 min，取出后放在冷水浴中冷却至室温，于490 nm波长处测定其吸光值。传统的硫酸-苯酚测糖法的操作过程是：取1.00 mL样品加1.00 mL水，加1.00 mL 6 %苯酚摇匀后再加入5 mL浓硫酸，振荡显色，静置30 min后，于490 nm处检测其吸光度。加入硫酸时系统显色温度相差较大，而造成相应的偶然偏差。而改进后的方法，由于先把水和硫酸混合，对浓硫酸起到了稀释作用，用冰水冷却最后加入苯酚晶体，配成显色液。通过沸水浴加热来使其显色，保证了反应系统温度一致，很好地解决了

4、检测重现性与准确度的问题。1.3.3去除杂质方法的比较在多糖提取的过程中，蛋白与淀粉的去除会影响到多糖的纯度与得率。因此本实验采用50%微波火力浸提30min，重复两次提取。考察了Sevage法与三氯乙酸法去蛋白法；同时也考察了淀粉一步消化法与两步消化法。正交实验见表1。实验结果见图 1。Sevage法三氯乙酸法一步消化法两步消化法30%醇沉 图 1 正交实验结果由此可以看出：淀粉一步消化所得多糖略高于两步消化所得，可能是由于在较短的时间内淀粉未去尽，而淀粉本身就是一种多糖物质，为了得到较纯的米糠多糖，实验优先考虑采用两步消化法；在去蛋白的方法中，比较、得知，采用Sevage法与三氯乙酸法所得

5、米糠多糖含量差别不大，考虑到Sevage法毒性较大，耗时较长，实验优先考虑三氯乙酸法。1.3.4 米糠多糖提取方法选择1.3.4.1 微波浸提法脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：10混合置于50微波火力下浸提30min，冷却，离心得上层液，重复提取两次，合并上层液。在上层液中加入0.5的耐高温-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后，再加入0.25的0.5的耐高温-淀粉酶，在相同的条件下保温消化15小时，离心得上清液。用30的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH值4.5（即米糠蛋白等电点，pI），置于4oC冰箱中静置过夜，使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。在上述得到的上清液中

6、，加入无水乙醇，使其含量为30（V/V），置于4oC冰箱中静置过夜，离心，得到米糠粗多糖RBPa溶液。用722型分光光度计测其吸光值，计算米糠多糖含量。1.3.4.2热水蒸煮浸提法脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：10混合置于110oC水浴锅中，使其保持沸腾状态2小时，期间不断搅拌，定时补入损失的水分，冷却，离心得上层液，重复提取两次，合并上层液。下续步骤同1.3.2.2。1.3.4.3 超声波浸提法 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：10混合，在80oC条件下超声提取30min，冷却，离心得上层液，重复提取两次，合并上层液。下续步骤同1.3.2.2。1.3.5比较结果 上

7、述方法均是参考了有关文献报道，采用的提取率相对较高的实验条件。通过722型分光光计对两种糖含量的测定，见图2。可见，微波法不仅在提取时间而且在糖的浸出率方面更具有优势。因此实验采用微波浸提法，并对提取时间，提取火力进行了研究。 图 2 3种提取方法所得米糠多糖含量1.3.5 微波浸提工艺1.3.5.1 微波提取 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：8混合，分别在50微波火力条件下浸提30min（），50min（）；100微波火力条件下浸提30min（）、50min（）。冷却，离心。各重复两次提取，合并上层液。1.3.5.2 两步消化法去除淀粉 在上层液中加入0.5的耐高温-淀粉酶于70

8、oC的水浴锅中保温消化2小时后，再加入0.25的0.5的耐高温-淀粉酶，在相同的条件下保温消化15小时，离心得上清液。1.3.5.3 三氯乙酸去除蛋白质 用30的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH值4.5（即米糠蛋白等电点，pI），置于4oC冰箱中静置过夜，使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。1.3.5.4乙醇沉淀米糠多糖在上述得到的上清液中，加入无水乙醇，使其含量为30（V/V），置于4oC冰箱中静置过夜，离心，得到米糠粗多糖RBPa。1.3.5.5 不同提取条件下米糠多糖含量比较 图 3 微波提取4种条件所得米糠多糖含量 由图 3得知，微波提取条件，可见微波火力增大会对多糖造成一定的破坏；提取时间过长也存在同样的情况。当微波辐射时间一定时，微波火力越高，物系吸收微波能越多，物系温度升的越快，固液传质速度亦越快；且温度越高，对物料细胞破坏作用越大，有利于物料有效成分浸出。但当微波火力增加到一定程度时，微波有可能促使米糠多糖分解，反而使米糠多糖提取率下降。1.3.5.6 真空冷冻干燥将微波方法所得的米糠多糖RBPa透析48小时后，冷冻干燥得到RBPa的固体粉末。2 米糠多糖RBPa的理化性质RBPa为淡黄色絮状固体，无味。苯酚硫酸试剂反应均呈棕红色，与碘反应不显蓝色；易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮，无甜味，无挥发性，水溶液为浅黄色。