吊兰的组织培养

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1、孟佳（东;I110001)Tissue Culture andMENG Jia (Northeast Yucai Middle Schooophytum comosumlogy Laboratory 110001)摘要：本文通过对银边吊兰进行的组织培养，究了以MS培养基为基础进行的吊兰愈伤组 织诱导和分化所需的植物激素种类和含量，记录其生长过程，并对组织培养过程的一般方法 和出现的问题进行了研究和总结。Abstract: Through the tissue culture of Chlorophytum comosum，we studied the effects of kinds and

2、concentrations of phytohormone densities in the MS medium on the callus induction and differentiation, also, studied and summarized the general method and the problems in the course of the tissue culture.关键词：吊兰，组织培养，愈伤组织，分化Key words： Chlorophytum comosum, tissue culture, callus, differentiation绪论：1.

3、 植物组织培养（Plant Tissue Culture是植物组织和细胞培养的简称，又叫 植物体细胞遗传学或植物克隆，是基因工程的一个环节，生物工程的重要组成部 分。植物组织培养不涉及到基因的遗传重组，所以克隆出的植物与其源植物具有 完全相同的遗传背景，因此克隆植物的性状较一致。另外对一些通过种子繁殖较 困难或后代产生重大分离的物种而言，组织培养技术更实用。同时这种技术具有 植物生长周期短、节省空间、不受环境季节影响等许多优势。1965年瓦斯尔和黑尔德埔兰特首次以胡萝卜的实验证明了植物细胞具有全 能性，这意味着一个植物细胞中的基因表达方式给予这个细胞一种潜力，即在成 熟植物体中它能成为任何类型

4、的细胞，反过来，当条件适宜时，任何具有生活力 的植物细胞（包括那些已高度分化了的细胞）都能脱分化，重新回到“胚性细胞” 状态，即愈伤组织，进而再分化成完整的植株。这一发现带动了植物细胞组织培 养技术的快速发展。经过世界各国科学家30多年的不懈努力，这一技术渐趋成 熟。迄今700多种植物可以进行茎尖培养或由愈伤组织再生植株。组培生物技术 为提高主要无性繁殖经济作物的种苗质量和繁殖系数，降低生产成本，减少环境污染，发挥了巨大的作用。以无性繁殖为主的经济作物是高效、优质、创汇、生 态农林业的重要组成部分，尤其是西部开发、贫困地区脱贫致富的重要支柱产业， 在当前我国种植业结构调整中占重要地位。2. 吊

5、兰(Chlorophytumcomosum)，别名挂兰、钓兰、折鹤草、鸭跖草、兰草参 百合科吊兰属，多年生宿根常绿草本植物。因其叶和根形态 似兰，而又花梗横生倒卧，宜悬空凭虚而得名。肉质须根， 根系发达，贮有大量水分。叶簇生，线状披针形，长20-45 厘米。花茎细长，高出叶面。总状花序，小花白色，不显 眼，夏季开放。花葶从叶腋抽出，弯垂而下，花后变为匍 匐枝，顶部长出气生根，萌发出新植株。原产于非洲南部， 性喜湿润，具较强的抗旱能力，喜半阴环境，不耐霜冻。 一年四季，翠绿依然，有”绿色仙子”之美称。家庭常见 栽培有金心吊兰，叶中心部具黄色纵条纹；银边吊兰，叶缘绿白色；金边吊兰， 叶缘黄白色。吊

6、兰繁殖容易，一般多采用分株繁殖方法。插瓶水养易成活。生长 适温10 25C。吊兰虽称不上名贵花卉，但吸收空气中有毒化学物质的能力在花卉却首屈一 指，效果甚至超过空气过滤器。美国航空及太空署的环境专家比尔、沃尔弗顿发 现，吊兰吸收空气中有毒化学气体的能力，较其它实验植物高，在空调房间里只 要放一盆吊兰，在24小时内可将室内的一氧化碳、二氧化碳、二氧化硫、氮氧 化物等有害气体吸收干净，并将它们输送到根部，经土壤里的微生物分解成无害 物质后，作为养料吸收。吊兰可清除甲醛污染，有极强的吸收甲醛的能力，15 平方米的居室，栽两盆吊兰，就可保持空气清新，不受甲醛之害。此外，在疾病 的防治上，吊兰具有活血接

7、骨、养阴清热、润肺止咳、消肿解毒的功能。在植物组织培养研究方面，以吊兰为实验材料的报道还不多。基于此，本文 对吊兰的组织培养方法作了阐述，并对组织培养的一般方法和可能出现的问题进 行了系统的分析和总结。吊兰的组织培养1材料类别 银边吊兰的叶片。2培养条件配方是MS培养液+琼脂+肌醇+激素。1）诱导培养基激素含量：X组IAA6-BAA组1.5mg/L2mg/LB组1mg/L2mg/LC组1mg/L1.5mg/L2）分化培养基激素含量:x组IAA6-BAa组2mg/L1mg/Lb组1.5mg/L1mg/Lc组1mg/L1.5mg/LX1组2,4-DKT （激动素）ZT （玉米素）A1组2mg/L0

8、.1mg/L0.1mg/LB1组1.5mg/L0.1mg/L0.2mg/LC1组1.5mg/L0.5mg/L0.2mg/LD1组1mg/L0.5mg/L0.5mg/LE1组1mg/L1.0mg/L0.5mg/L上述培养基均加入蔗糖30 g L-1，琼脂12 g L-1，肌醇100mg L-1，pH均 调至5.8 （用1mol/L的NaOH溶液），用锥形瓶盛装，并用铝铂封口。3操作及生长、分化情况3. 1高压灭菌将培养皿、镊子、剪刀、蒸馏水、培养基等放入高压灭菌锅中， 加盖灭菌1h后取出，放在超净工作台（clean work station table）上。3. 2接种前的操作 实验前先打开超净

9、工作台的紫外线灯，灭菌10min后关闭。 打开吹风机，点燃酒精灯，确保实验时的操作在酒精灯后进行。穿上白大褂，戴 上口罩，用酒精棉球擦拭手、实验台和实验器具，并用酒精灯的外焰部分将镊子、 剪刀等灭菌，待冷却后使用。烧一下瓶口和铝伯，度为20C。3. 4分化培养3. 3愈伤组织的诱导培养 从生长旺盛、无病虫害的吊兰上剪取叶片。将吊兰 叶片用蒸馏水洗净后放于无菌培养皿中进行消毒。用75%的酒精溶液灭菌45s, 再用10%的双氧水灭菌6min。用蒸馏水清洗三次。再用镊子和刀将其剪成小段， 取幼嫩部分接种于培养基X中，每瓶接45个外植体。最后在酒精灯外焰上 盖紧，放入光照培养箱中。光照10h，温度为2

10、6C，夜间温观察：无菌操作的成功率为78.3%。约两周后顶芽开始萌 动，并在基部形成少量愈伤组织。三周后长出嫩芽，叶片直 立，约2cm长，长势良好。四周后无大变化。转至相同培养 基上继续培养两次。叶的数量有所增加，但愈伤组织无大变 化。筛选出未发生污染且生长状况良好的芽和愈伤组织块，用无菌解剖刀在培养皿中切取，转移至培养基a中进行继代培养。观察：一周后无大变化。两周后芽的数量增多至4-5个，少数 生出白色纤细的根。四周后嫩绿色叶片展开，最高约6cm，最 短约1-1.5cm。六周后为十片叶左右，最高约8cm，颜色鲜艳。 七周后无大变化，大部分没有生根。叶多，变成深绿色，有些 叶片尖部发黄。两个月

11、后转至X1培养基中培养。观察：三天 后尚未长根。一周后颜色稍变浅。两周后叶片数量增多，开始 长根。一个月后大部分长根，但很短，约2cm长。叶片长到10cm左右。吊兰没 有开花。3. 5讨论(1) 吊兰的组织培养相对比较复杂，成功需要较强的经验性。比较适合的激素 为X3组。（2）实验时吊兰在生长过程中有叶片发黄现象，经过分析可能是由以下原因引 起的。一是养料过剩，超过了植株的需要量。二是长时间未转移植株。培养基中 所含的各种营养元素已被耗尽，氮、磷、钾三要素也没及时补充，植株缺少养分， 叶片出现黄薄现象。三是见光太少，导致叶绿素降低，叶片变黄。四是光线过强。 吊兰对光线敏感，若光线太弱，则叶色变

12、得浅淡；若光线过强，则叶片枯黄，甚 至枯萎死亡。（3）外植体消毒时间的掌握。因为吊兰的组织培养是个新的尝试，消毒时间的 长短要靠自己摸索。第一次实验时灭菌时间为酒精1min，双氧水10min，结果虽 然污染率不高，可很多组织都被杀死了。在后来的实验中发现酒精45s,双氧水 6min比较合适。（4）吊兰的叶片剪碎后要选取幼嫩的部分进行接种。（5）诱导培养基的中间繁殖体中丛芽的数量多于愈伤组织的数量。继代增殖时 主要通过芽生芽的方式。从实际的经济角度考虑，大规模进行组织培养快速繁殖 时应采用丛生芽进行分化培养。（6）由于实验仍在进行，尚未到试管苗移植这步。二 组织培养的一般方法及重点问题1. 组织

13、培养一般分为五个步骤：1）培养基的配制培养基的成份随植物的种类、外植体的类型、培养阶段的不同而不同。一般来说， 培养基应含有大量元素、微量元素、铁盐、维生素、激素、糖和琼脂等物质，有 时还在培养基中添加有机附加物，如活性炭、椰子汁等。培养基的配制按如下步 骤进行：（1）根据培养材料确定培养基。一般可先试用MS培养基，若不适，再改 用其它培养基。附：MS培养基A组：（大量元素）（单位：mg L-1，下同）NH NO 1650 ； KNO 900 ； CaCl 440 ； MgSO 7H O 370； KH PO 17043324224B组：（微量元素）KI 0.83 ； HBO 6.2 ； Mn

14、SO - HO 22.3 ； ZnSO - 7H O 10.6334242C组：Na MoO - 2HO 0.25 ； CuSO - 5H O 0.025； CoCl - 6H O 0.0252424222D组：EDTA 37.3； FeSO4 - 7H2O 27.8E组：（有机物）甘氨酸（CHNO ） 2.0 ；盐酸硫胺素（VB ） 0.1 ；烟酸0.52 526吲噪乙酸（VB1）1-30 ；盐酸毗哆醇0.5 ； 6-苄基氨基腺嘌吟（6-BA） 0.04-10 ； IAA （吲噪乙酸）0.01-3其他溶液的配制：1mol/L的NaOH溶液，0.1mg/mL的6-BA溶液，0.1mg/mL 的

15、 IAA 溶液，0.1mg/mL 的 2,4-D 溶液，0.1mg/mL 的 KT 溶液，0.1mg/Ml 的 ZT 溶 液。（2）按照确定的培养基配方配制培养基，一般包括溶化琼脂、加入蔗糖和母液、 调整酸碱度、定容、分装等步骤。（3）对分装好的培养基进行高压灭菌，将灭菌好的培养基放入接种室中。2）无菌培养物的建立（1）外植体的切取及消毒。用于快速繁殖的外植体可以是种子、茎尖、叶片、 花序等。外植体必须先进行消毒，其消毒方法是：从植株上切取所需的部分，用 水冲洗干净，而后移入超净工作台中用消毒剂（次氯酸钠、氯化汞、酒精等）进 行消毒，但不管使用什么消毒剂，消毒后的外植体应该是无菌的，而其本身没

16、有 被消毒剂杀死。（2）将消毒后的外植体接种到培养基中，接种时要求迅速准确，防止交叉污染。3）中间繁殖体的诱导和增殖消毒后的外植体在培养基上培养一段时间后可诱导出从芽、胚状体、原球茎、根 状茎，这些培养材料称为中间繁殖体。对中间繁殖体进行切割、继代培养就可以 进行中间繁殖体的增殖。中间繁殖体的增殖速度随花卉的种类、培养基、培养条 件的不同而异，因而对具体花卉需进行试验，找到合适的繁殖条件，以达到“快 繁”的目的。4）生芽、壮苗与生根当中间繁殖体增殖到一定数量后快速繁殖进入生芽、壮苗和生根阶段。如果是通 过从芽繁殖，则不需经过生芽直接进行壮苗、生根，如果是通过其它途径则需先 将中间繁殖体转移到生

17、芽培养基上，然后再转移到壮苗生根培养基上。在壮苗生 根培养基上，大多数花卉要分离成单苗。5）试管苗移栽和管理对已经生根的试管苗及时移栽是花卉快繁的最后工作，而且也是十分关键的工 作。由于试管苗是在无菌、有营养供给、适合光照、温度和100%相对湿度环境 中生长的，因而刚出瓶的试管苗对外面环境不太适应，稍一不慎便会造成大量死 苗。所以对刚出瓶的试管苗要给予特别的照顾，适当的温度、弱光照、高的空气 湿度、适宜的基质及对病虫害的有效控制是提高成活率的关键。2 .影响组织培养的因素因素大致可归结为三大类，即外植体、培养基成份和培养条件。1）外植体是影响成功的一个重要因素。适宜的外植体应根据植物种类确定，

18、不 仅要考虑到获得外植体的材料来源、器官和组织的类型，同时还需要考虑外植体 的大小、生理年龄等。外植体可以是植株上的任何一部份，主要应用的有幼叶、 茎尖分生组织、种子、鳞茎、球茎、根茎、花序、茎段等。选取的外植体必须易 于消毒，在适宜的培养基上起动率高。2）培养基是影响成功与否和效率的关键因素。培养基组成的各成份，矿物盐、 糖的浓度、维生素、铁盐、激素和有机附加物都会对快繁过程产生影响，其中以 激素类物质影响最大。培养基成份应根据植物的种类、外植体的类别和阶段来确 定。在最初的外植体培养中使用较高浓度的生长素或细胞分裂素，在继代培养中 激素浓度可适当降低。生芽阶段使用细胞分裂素的浓度高而在生根

19、阶段使用生长 素浓度高等。3）培养条件是影响成功的另一个关键因素。培养条件一般包括温度、光照、气 体状况等，培养条件同样依不同的植物、不同的培养阶段而不同。就温度而言， 大多数培养的植物组织2（W8C即可满足生长所需，其中2砰2色最适合，但也有不少 例外。其次是光照，在初代培养一般需要一段时间暗培养，继代繁殖散射光即可， 而在生根状苗阶段则需要强光才能形成芽和根。渗透压与植物组织的生长和分化 很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。 通常12个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6 个大气压时植物组织即无法生存。一般植物组织生长的最适宜pH

20、为56.5。 在培养过程中pH可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。3 .污染问题污染问题是组织培养过程中常见的而且也必须给予高度重视的一个问题。污 染率达20%很常见，有时甚至高达50%。经分析，组织中的污染来源可分成三 大类：第一类是材料带菌，第二类是接种污染，第三类是培养过程感染。材料带 菌就是选用的外植体因过大等原因本身带有病菌，或继代培养的材料本身带有病 菌。针对这种情况，要求初代接种时使用大小适宜的外植体，在继代的培养中， 每次继代之前都要对继代的材料进行仔细检查，凡是污染的材料应予以丢弃。接 种污染是由于在接种过程中将病菌传入培养材料而造成的。引起接种污染可能有 三个原

21、因：第一是由于超净工作台滤出的空气中带菌超标造成的，属于这种情况 要及时修理或更换超净工作台；第二是由于交叉污染造成的，针对这种情况，要 求接种者操作细心，接种用的镊子不要与酒精灯、台面等接触，一旦接触应立即 进行消毒处理，同时各瓶材料接完时要对镊子进行消毒；第三种是由接种者呼吸 等原因造成的，针对这一点，要求接种者在接种时应用酒精棉擦手，穿上无菌的 白大衣，带上口罩和帽子。在材料培养的过程中，如果环境中病菌多、湿度大、温度高，同样会使培养 的材料污染。这就要求我们要经常进行清洁卫生，对培养空间定期进行消毒处理， 及时清除污染材料，转移继代材料。有时候高压灭菌不彻底，会造成严重污染，这点也很关

22、键。4.褐变问题组织培养中的一大问题是初代培养中外植体易于褐变。从我们的经验和别人 研究结果看可采取以下方法：初代培养时，剥取组织块最好能够在无菌水中进 行；初代培养采用液体培养比用固体培养效果好；在培养基中单独或复合使 用防褐变物质：芸香苷50-100毫克/升、20%硫代硫酸钠溶液5毫升/升、柠檬酸 0.05-0.5%、活性炭1-4克/升、聚乙烯毗咯烷酮（PVP） 5-10克/升；从开始 培养到成活的一段时间内保持摄氏温度17-20度；调整好培养基的酸碱度，以 酸碱度为5.5时成活率高；6-8月份高温季节，外植体易褐变，成活率低； 从新生的假球茎上取芽，不仅能够减少污染，而且成活率高。5 .

23、无菌苗移栽如何创造适宜的移栽条件，提高无菌苗移栽成活率呢？有研究表明，首先， 要保持试管苗的水分供需平衡，要达到这一目的，一是要增加空气湿度，减少叶 面蒸发；二是要注意介质湿度的控制，促进尽早发根，增加水分吸收。第二要选 择适宜的介质，并对介质进行灭菌处理。介质是影响试管苗成活率的又一个重要 因素，疏松通气、适宜的保水性、清洁卫生是移栽试管苗对介质的基本要素。常 用的介质有蛭石、珍珠岩、粘沙、谷壳、锯木屑、磨菇渣等，将这些介质根据需 要按一定的比例混合，然后经过灭菌处理即可供移栽使用，这样的介质既可保水 又利于通气，因而有助于根的成活。第三要防止杂菌兹生。为了防止菌类兹生， 除要求对移栽试管苗

24、的基质消毒外，另外两种措施可以保护幼苗不受或少受病毒 浸害，一是在试管苗刚移出时，用0.1%的高锰酸钾或一定浓度的新洁尔灭溶液 浸苗，另一种则是在幼苗移栽扣定期喷洒一定浓度的杀菌剂，如百菌清、多菌灭、 托布津等，浓度以1/8001/1000为宜。可以结合喷施叶面肥进行。第四，光温 要适中。刚移出的试管苗要求光线弱，而成活后则要求光照强些，同时光照的弱 强随植物种类而异，观叶植物一般要求遮光。附:小资料一一最近日本千叶大学园艺系教授古在丰树发明了不使用糖分的植 物组织培养法，为花卉苗木生产开辟了新途径。据介绍，糖分是培养基中必不 可少的营养成份，但因为含糖，无用甚至有害微生物一旦侵入培养基，便会

25、迅 速繁殖，夺取培养基中的营养成分，侵入植株导管，妨碍植物吸收水分和养分 的功能。古在丰树教授发明的无糖培养法，关键在于只靠光合作用使植物生长。 这一新型苗木生产技术目前已被运用于蝴蝶兰等观赏植物的大量生产。三体会1. 科学研究的实验并不容易，它与物理化学的课堂实验有很大差别。实验课是 要求我们做一些固定一起固定步骤的实验，目的是锻炼我们的实验基本技能，培 养我们的观察能力。而科学研究的实验则要你自己设计步骤和药品的量，需要你 自己思考如何改进实验步骤。组织培养的技术虽不是很复杂，但需较强的经验性， 尤其是添加多少激素，不是单靠书本可以学会的，没有现成模式变更需要尝试， 方法要靠自己来摸索，来创新。2. 观察也是很重要的，不观察就永远不知道失败在哪里，成功又在哪里。观察记 录要实事求是，决不能耍小聪明。科学不容许半点虚伪。3. 在组织培养的过程中失败是在所难免的，我们操作时的确碰了不少钉子。从 五颜六色的污染物到后来的褐变，即使谨慎的思考精确的实验仍难避免。看来科 学研究的成功是需要一个人的韧性的。有耐心有毅力才能获得最后的成功。四致谢在整个实验的过程中得到了东北育才学校的大力支持和中国科学院沈阳分院的郝林博士及东北育才学校的马万红老师的悉心指导与鼓励，在此表示衷心的感谢！2001年8月参考文献表张志良主编植物生理学实验指导（第二版）高等教育出版社1990年2月