体外培养DCCIK细胞杀伤白血病细胞实验研究

《体外培养DCCIK细胞杀伤白血病细胞实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《体外培养DCCIK细胞杀伤白血病细胞实验研究（13页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、体外培养DC-CIK细胞杀伤白血病细胞实验研究 张素芳， 郭晓玲，张娜娜，张静楠，任金海，郭晓楠 （河北医科大学第二附属医院 血液科， 河北 石家庄050000） 摘 要:目的:未缓解的急性白血病患者的外周血中存在一定比例的白血病细胞，能否诱导CIK细胞的增殖用于复发难治白血病的挽救治疗值得探讨。体外诱导培养缓解期及未缓解期急性白血病患者来源的DC-CIK细胞，比较其增殖能力，免疫表型及杀瘤活性的变化。方法:提取复发难治白血病患者和缓解期患者的研究对象的外周血单个核细胞，按常规方法诱导产生DC-CIK细胞，在培养过程中计算细胞增殖倍数，用流式细胞仪检测CD3CD8、CD3CD56双阳性率，并在

2、细胞增殖期检测比较其对K562细胞及患者单个核细胞的杀伤活性。结果:缓解组和未缓解组来源的DC-CIK细胞均不断快速增殖，培养第15天时，缓解组CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞分别占(87.51.29）%，(63.81.98）%，未缓解组分别占(88.63.4)%,(66.84.1)%，此时应用CCK-8法测得在效靶比为20:1时，缓解组对K562细胞的杀伤率为（42.643.25）%，未缓解组为（57.492.87）%；相同效靶比下，未缓解组对患者的单个核细胞的杀伤率为（67.297.95）%。结论:应用未缓解患者的外周血单个核细胞,同样可以培养出DC-CIK细胞，具有与缓解组来源的

3、DC-CIK细胞一致的高增殖活性和高CD3+CD8+、CD3+CD56+表达，一样对K562细胞杀伤活性较强，并对患者单个核细胞具有特异杀伤活性，未缓解患者来源的CIK细胞中未检测到白血病细胞残留，可以应用于难治白血病的挽救治疗。 关键词:细胞因子诱导的杀伤细胞；树突状细胞；生物学活性；白血病；细胞因子Biological Activity of DC-CIK Cells And effect against LeukemiaK562 Cells In VitroZHANG Su-fang，GUO Xiao-ling，ZHANG Na-na，ZHANG Jing-nan，REN-Jinhai，

4、GUO Xiao-nan（Hebei Medical University The Second Affiliated Hospital,Shijiazhuang of Hebei，050000，China） ABSTRACT：Objective：DC-CIK cells source from remission and non-remission of acute leukemia patients Induced in vitro ,compared their changes of proliferation,immune phenotype and tumoricidal activ

5、ity .Methods：Peripheral blood mononuclear cells of objects were extracted and induced by conventional methods into DC-CIK cells,calculated proliferation multiples,CD3+CD8+,CD3+CD56+ double-positive rate detected by flow cytometry,and killing activity against K562 cells and mononuclear cells was comp

6、ared in cell proliferation.Results：DC-CIK cells come from Remission and non-remission group were continued proliferating rapidly,on the day of 15 cultured ,remission group cells with CD3+CD8+ and CD3+CD56+ accounted for(87.51.29)%, (66.84.1)%,this time measured by CCK-8 in the target ratio of 20:1,

7、the killing activity of remission group to K562 was (42.643.25)%,non-remission group (57.492.87)%;the same effector to target ratios,non-remission group to mononuclear cell of patients was(67.297.95)%.Conclusion:Peripheral blood mononuclear cells of non-remission patients , could also been developed

8、 to DC-CIK cells, had high proliferative activity and high CD3+CD8+,CD3+CD56+ expression as the remission group,and the killing activity to K562 cells were both strong,DC-CIK cells come from non-remission group even had specific killing activity against mononuclear cells of patients. Key words；Dendr

9、itic Cells; Cytokine Induced Killer Cells; Biological Activity; leukemia; Cytokines白血病在我国发病率较高，对人生命危害性极大，目前以药物治疗、骨髓干细胞移植为主，不仅不能完全清除瘤细胞，而且存在难治复发等难题。随着医学不断发展，细胞免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗后的第四大肿瘤治疗方法。其中树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）是两个主要部分，目前以来源于健康供者和缓解期患者的CIK细胞研究最常见，未缓解或初治白血病患者外周血存在一定比例的白血病细胞，能否激发出抗肿瘤CIK细胞值得进一步探讨，培养

10、出的CIK细胞是否残存白血病细胞值得进一步探讨。本研究通过分离未缓解急性白血病患者、缓解期急性白血病患者的外周血单核细胞，联用相关因子体外刺激出树突状细胞致敏的杀伤细胞，观察其形态、增殖能力、表面标识和细胞毒性变化,为进一步提高DC-CIK细胞的抗肿瘤和特异性，扩大白血病细胞免疫治疗的临床应用提供实验依据。1 资料与方法1.1 主要试剂 R P MI1640 培养液购自美国Gibco 公司 ， rhGM- CSF、r hIL -2 ， rhIL- 4、rhIFN-、rhTNF-均购自美国PeproTech公司，MabCD3购自美国Biolegend公司，用于流式细胞仪检测的标记抗体CD3、CD

11、4、CD8、CD16、CD56、CD34、CD45 均购自美国BectonDickinson公司 。1.2 靶细胞的来源 K562由本实验室保存。 患者单个核细胞来源于我院血液科住院复发难治的未缓解白血病患者以及缓解期患者的外周血样本，收集后冻存于液氮罐中。所有病例都完全按照 血液病诊断及疗效标准进行确定诊断的，主要是通过临床症状及体征的观察、外周血细胞的检查及形态分析、骨髓细胞的形态特征以及骨髓组织活检结果分析并结合细胞分子生物学及细胞免疫学的检测结果进行的综合分析。且均获得患者知情同意后方采集标本。整个实验研究遵循的程序已获得伦理委员会的批准实施。1.3 DC的体外培养抽取缓解期及未缓解期

12、（这里外周血细胞原始细胞比例均小于20%)急性髓系白血病患者的外周血5-8ml，分离单个核细胞，放于37、5C02培养箱中孵育2小时后，收集贴壁细胞种植于六孔板中，调整浓度为2l06ml，加入rhGM-CSF和rhIL-4，使终浓度分别为 1000 Uml、1000 Uml，置于37、5C02培养箱中培养。适时补充培养基及细胞因子。于收细胞前24小时加入rhTNF-使得1000 Uml，诱导DC细胞成熟。1.4 CIK细胞的扩增培养收集与上述细胞同源的悬浮细胞，调整细胞浓度为2l06ml，移至六孔板中，加入rhIFN-r 使终浓度为1000 Uml，然后放于37、5CO2培养箱内，24小时后，

13、向细胞悬液中加入rhIL-2达500 Uml、CD3McAb达50 ngml，继续培养，并适时补充培养基及细胞因子。1.5 DC细胞与CIK细胞共培养将成熟的DC细胞计数后与CIK细胞以1：5的比例混合培养，每3天计数一次，并补充新鲜培养基及细胞因子，每次调整细胞浓度到4l06ml。1.6 细胞免疫表型检测分别收集培养第1，9，12，15天的培养细胞，调整细胞浓度为1106/ml，用流式细胞仪检测来源于缓解组与未缓解组的细胞免疫表型 。1.7 CCK-8测定DC-CIK对K562细胞及患者单个核细胞的杀伤作用 将缓解组、未缓解组来源的DC-CIK细胞浓度调整为0.5106个/ml ，1106个

14、/ml，2106个/ml 作为效应细胞，同时取K562细胞和患者单个核细胞作为靶细胞，调整浓度为1105个/ml，即效靶比为5:1，10:1和20:1 ，在96孔板加入效应细胞和靶细胞各100l/孔，同时设靶细胞、效应细胞对照孔，均设3个平行孔，对照孔为单纯靶细胞100l100l RPMI1640和单纯效应细胞(DC-CIK)100l100l RPMI1640，于37，5CO2孵箱中培养24 h，每孔加入CCK-8 约20l，置37，5 CO2孵箱中继续培养4 h后，取出用酶标仪测定波长570 nm处 OD值，按下式计算效应细胞的杀伤率。杀伤率（）1（实验孔OD值效应细胞对照孔OD值）/靶细胞

15、对照孔OD值1001.8 统计学处理数据 采用 SPSS 16.0 统计软件分析 ，数据以均数标准差(X(_)S) 表示,细胞表面抗原比较采用重复测量方差分析,进一步两两比较采用 LSD- t 检验；细胞杀伤实验比较采用配对样本检验。以P 0.05为差异有统计学意义 。2 结果分析2.1缓解组与未缓解组来源的DC-CIK细胞增殖能力缓解组与未缓解组来源的细胞均按同样方案培养，在温箱中孵育过的贴壁细胞，经rhGM-CSF和rhIL-4诱导成树突状细胞，培育中细胞形态发生明显变化，细胞数量亦明显增加。培育第2天起细胞体积变大，边缘发出胞浆突起，外形不规整，并成团生长(见图1)。非粘附单个核细胞，最

16、初散在均匀分布，个头小，亮而圆，形体较一致（见图2），在多种细胞因子的诱导下，细胞增殖成团，培养的第4天，细胞形态开始呈现出不规则形（见图3）。从培养的第6天起，细胞明显增殖，成丛或以集落状态生长，并悬浮于培养基中（见图4）。在细胞培养的第6天将DC细胞与CIK细胞共培养得DC-CIK细胞，通过观察计数细胞，分析结果显示，两组细胞均不断快速增殖，（见表1），增殖倍数两组无显著性差异速度差别不大。镜下可见DC与较多的CIK细胞聚集成团（见图5），呈团块生长。图1 体外培养DC细胞的形态Fig.1 Morphology of DC after cytokine stimulation in vir

17、to (200)图2细胞因子刺激前的悬浮细胞Fig.2 Morphology of CIK before cytokine stimulation in virto (200)图3体外培养3天的CIK细胞Fig.3 Morphology of CIK after cytokine stimulation three days in virto (200)图4 体外培养6天的CIK细胞形态Fig 4 Morphology of CIK after cytokine stimulation six days in virto (200) 图5 体外培养9天的DC-CIK细胞Fig 5 Morpho

18、logy of CIK after cytokine stimulation nine days in virto (200)表1细胞增殖活性的比较Table 1 The relationship with proliferation of multiple and culture time分组增殖倍数9d12d15dDC-CIK(缓解组)16.391.8942.63.93*65.21.81*DC-CIK(未缓解组)17.002.1640.22.97*65.42.59* P0.05 vs the radio of effector to targe in front in the same g

19、roup2.2缓解组与未缓解组来源的DC-CIK细胞分子表型的变化应用流式细胞仪检测缓解组与未缓解组来源的DC-CIK细胞CD3+CD8+和 CD3+CD56+的表达，（见表2），分析数据提示，同时表达二者的细胞比例均随时间逐渐增加，且增加明显（p0.05），但两组间比较，CD3+CD8+和 CD3+CD56+双阳性比例的差别却不显著，无统计学意义。 表1 DC-CIK细胞免疫表型的变化Table 2 DC-CIK cells immune phenotypic changes(X(_)S,%)分组培养时间（天）CD3+CD8+CD3+CD56+DC-CIK(缓解组)123.45.363.81

20、1.35953.01.5831.41.141271.22.5949.01.01587.51.2963.81.92DC-CIK(未缓解组)121.87.32#4.011.63#9542.98#32.42.24#1271.41.82#503.2#1588.63.4#66.84.1#P0.05 vs DC-CIKs at the same day in different groups2.3未缓解组来源DC-CIK细胞培养前后白血病细胞比较实验中用细胞涂片法和流式细胞技术检测未缓解组培养前后标本中的原始细胞，并比较分析，均证实培养后原始细胞明显减少，培养前涂片平均值为(8.33.1)%，流式测得CD

21、34+细胞占(4.233.48)%；培养后涂片观察，显微镜下未见原始细胞，流式细胞仪测得表达CD34+的细胞比例降至平均（0.10.05）%，差异有统计学意义，即P0.05。 2.34 缓解组和未缓解组来源DC-CIK杀伤K562细胞活性比较 用培养15天DC-CIK细胞，在效靶比5:120:1范围内杀伤K562细胞，实验中，两组细胞对K562细胞均有较强杀伤力，未缓解组来源DC-CIK的作用略强于缓解组，但经过统计学分析，相同效靶比条件下二者的杀伤力的差异不明显，P值均大于0.05，（见表3）。表3 DC-CIK细胞对K562细胞杀伤活性比较 Table 3 DC - C1K cells k

22、illing activity to K562 cells(X(_)S,)分组效靶比5:110:、；120:1DC-CIK（缓解组）21.74.6428.93.7942.643.25DC-CIK（未缓解组）DC-CIK（未缓解组）30.42.73*42.383.2*57.492.87* * P0.05 vs the same radio of effector to targe 2.5缓解组和未缓解组来源DC-CIK杀伤未缓解组来源DC-CIK细胞杀伤活性的特异性患者单个核细胞收集缓解组和未缓解组来源DC-CIK细胞，在效靶比5:120:1范围内，以分别以K562细胞和冻存的患者单个核细胞为靶

23、细胞，比较二较对两者的杀伤活性。结果提示，相同效靶比条件下二者的杀伤力有显著性差异，显示了未缓解组DC-CIK细胞对患者单个核细胞的杀伤特异性，（见表4）。（类似表3）表4 缓解组和未缓解组来源未缓解组来源DC-CIK 对 K562 和患者白血病细胞的杀伤力(，XS)DC-CIK杀伤患者单个核细胞 未缓解组来源DC-CIK细胞的杀伤特异性比较 Table 4 killing activity of DC-CIK cells come from non-remissionkilling activity souce from non-remission to K562 cells and Leu

24、kemia cells from patient (X(_)S，)分组效靶比5:110:120:1K562K562细胞30.482.947342.66383.46257.22494.232.87DC-CIK（未缓解组）患者白血病细胞患者白血病细胞35.233.4347.695.9267.297.95P0.05 vs the same ratio of effector to target 这两个应该一样的（按您改的，如果靶细胞不一样，就不一样了，但是这样和原论文就不一样了，按原论文就是应该一样的，以哪个为准呢？）3 讨论白血病是一种造血功能逐渐衰竭的恶性疾病，严重影响着人的生命健康。当前有化疗

25、、骨髓干细胞移植、靶向治疗等治疗方法，但仍不能根治白血病，甚至不能缓解疾病。近年来过继免疫治疗(Adoptive cellular immunotherapy)成为一个迅速发展的领域,尤其是树突状细胞辅助的杀伤细胞（DC-CIK）疗法，以其强大的抗肿瘤效应越来越受到人们的关注，且其在减轻各种化疗并发症, 消除白血病微小残留病（MRD),减少复发，延长患者生命上空间广阔。CIK细胞是在体外由多种细胞因子（如IFN-、CD3McAb、IL-2等）共同诱导获得的一群异质性细胞，多数细胞带有T细胞标志，部分带有NK细胞标志，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，而这部分效应

26、细胞被证明为CD3+CD56+细胞1-4。CIK细胞增殖能力明显高于LAK和AK-T细胞5，抗瘤活性亦较之强。而且CIK细胞对正常细胞毒性较小，可以保存3/4以上的CFU-GM集落6。CIK细胞除本身有直接杀伤恶性细胞的作用，还可机通过机体免疫机制间接杀死恶性细胞，培育的杀伤细胞表面的FasL分子，不仅使Fas+恶性细胞发生程序性死亡，还防止效应细胞发生Fas-FasL程序性死亡，展示了很好的抑瘤杀瘤功效7。CIK细胞对急性白血病患者8有较好疗效，对G0期CD34+白血病细胞9有明显的杀伤作用。以往白血病的CIK免疫治疗细胞来源都是处于缓解期的外周血单单个核细胞，未缓解的患者外周血存在一定数量

27、的白血病细胞，能否激发CIK细胞的增殖？培养后的CIK细胞中是否存在残留的白血病细胞? 能否应用于难治性白血病的挽救治疗都值得进一步探讨。已有研究表明，髓系白血病细胞能诱导分化为白血病树突状细胞，呈递已知或未知的白血病抗原，从而诱导产生T淋巴细胞的抗白血病效应10，11，共培养DC和CIK12，可以分别增强两者的增殖活性，可使IFN分泌量增高13。 以往白血病的细胞免疫治疗细胞均来源于缓解期白血病患者，能否用未缓解者标本激发出抗肿瘤CIK细胞值得进一步探讨。本研究中比较缓解组和未缓解组两组来源的DC-CIK细胞增殖能力，缓解组DC-CIK不断增殖到原来的(16.391.89)倍，(42.63.

28、93)倍，(65.21.81)倍，未缓解组也不断增殖到(17.02.16)倍，(40.22.97)倍，(65.42.56)倍，增殖能力明显增加；应用流式技术检测，缓解组来源的CD3+ CD8+细胞由最初的（23.45.36）%随时间增加到第15天的(87.51.29)%，CD3+CD56+细胞由最初的（3.811.35）%增加到第15天的(63.8 1.98)%；未缓解组来源标本刚分离时CD3+CD8+（21.87.32）% ，CD3+CD56+（4.011.63）%，培养第15天CD3+CD8+比例达到(88.63.4)%，CD3+CD56+细胞占(66.84.1)% 。细胞陪养中具有抗肿瘤

29、活性的CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞比例均明显增多， 增殖能力较强，CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞比例逐渐增加，与文献报道一致14，可为临床提供足量的免疫活性细胞，满足临床治疗的需要15。（写下具体的试验结果）本研究表明，可以由未缓解者的外周血单个核细胞诱导出DC-CIK细胞，培养后残留白血病细胞消失，且具有更强的肿瘤杀伤特异性，探索了一种更为有效的免疫治疗方法， 进一步提高DC-CIK 细胞的抗肿瘤特异性，为进一步扩大白血病细胞免疫治疗的临床应用提供理论依据。参考文献:1 Shi M，Zhang B，Tang ZR，et a1Autologous cytokineindu

30、ced killer cell therapy in clinical trial phase I is safe in patients with primary hepatocellular carcinoma.World J Gastroenterol，2004，10(8)：114611512 Leembuis T，Wells S，Scheffold C，et a1A phase I trial of autologous cytoking-induced killer cells for the treatment of relapsed HD and NHLJ,Biol Blood

31、Marrow Trans，2005，21(13）：1811873 Hare K，7enkinson E，Anderson G.CD69 expression discriminates MHC-dependent and-independent stages of thymocyte positive selectionJ Immunol，1999，162(7)：397839834 Schmidt-Wolf IG,Lefterova P,Mehta BA,et a1.Phenotypic characterization and identification of effector cells

32、 involved in tumor cell recognition of cytokine-induced killer cells.Exp Hematol，1993，21(13)：167316795 Schmidt-Wolf GH，Negin RS，Kiem H.P.et a1Use of a SCID mousehuman lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activityExpMed，1991：1391496 Schmidt-Wolf IGH，Negr

33、in RS，Kiem H，et a1use of a SCID mousehuman lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activityJExp Med，1991；174:1391497 Verneris M R，Komacker M，Mailander V，et a1Resistance of ex vivo expanded CD3+CD56+ T cells to Fas-mediated.Cancer immunology，immunotherapy -

34、C，2000；49：3353458 童春容，耿彦彪，陆道培.自体细胞因子诱导的杀伤细胞治疗急性白血病的临床研究.北京医科大学学报，2000，32 ( 5) :4734779 惠吴函，徐娟，万岁桂，等.CIK 细胞对G0 期急性髓系白血病细胞的杀伤作用.首都医科大学学报，2007，28( 5) : 66666710 Liepert A，Grabrucker C，Kremser A，et al Quality of T-cells after Stimulation with leukemia-derived dendritic cells( DC) from patients with acut

35、e myeloid leukemia( AML) or myeloid dysplastic syndrome (MDS) is predictive for their leukemia cytotoxic potentialJ.Cell Immunol，2010，265( 1) :233011 Kremser A，Dressig j，Grabrucker C，et al Dendritic cells ( DCs) Can be successfully generated from leukemic blasts inindividual patients with AML or MDS

36、: an evaluation of different methodsJ.J Immunother.2010，33( 2) :185199 12 Mrten A，Ziske C，Schttker B，et a1.Interactions between dendritic cells and cytokine-induced killer cells lead to all activation of both populations.J Immunother(1997)，2001.24：5021013 Fujii S，Shimizu K，Kronenberg M，et al.Prolong

37、ed IFN gamma producing NK response induced with alphaga lactosylceramide loaded DCs.Nat Immunol，2002，3( 9) :86787414 Marten A Renoth S，von-Lilienfeld-Toal M，et a1Enhanced lytic activity of cytokine-induced killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic ce

38、lls.Haematologica，2001，86：1029103715 Zoll B，lefterova P，Ebert 0，et a1Modulation of cell serface markers on NK like T lymphocytes by using IL-2、IL-7 or IL-12 in vitro stimulationCytokine，2000，12(9)：13851390文题页：论文题目：体外培养DC-CIK细胞杀伤白血病细胞的实验研究全部署名作者及其单位：张素芳，郭晓玲，张娜娜，张静楠，任金海，郭晓楠；作者单位均为河北省医科大学第二医院 第一作者个人资料张素芳，女，1981年5月生，汉族，河北省保定人，硕士学位，主要研究方向为恶性肿瘤的细胞免疫治疗，电话18203227862，邮箱 sxdtzsf 通信作者郭晓玲，手机13932113351，邮箱13932113351，地址 河北省石家庄市新华区和平西路215号，邮编 050000列表说明每位署名作者在研究工作中承担的任务和对研究成果的贡献张娜娜，收集临床标本；张静楠，任金海，郭晓楠，实验指导者；声明该研究工作无任何形式的利益冲突，不受资助方的任何影响，作者独立取得实验数据，并对数据及数据统计分析的准确和可靠性负完全责任；当前文稿未投过其他杂志。