细胞活力的测定

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1、皮肤成纤维细胞和THP-1indent细胞：皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。THP-1细胞是悬浮的。由于我们实验室养细胞的时间也不是很长，所以也只能说说自己平时的操作了。 先说皮肤成纤维细胞。当细胞铺满瓶底，也就是细胞与细胞之间没有间隙时，就可以传代了。一般十天左右传一代。先吸弃旧培养液，用D-Hanks液洗两遍，再 加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后静置两分钟左右，最好是能在显微镜下观察，当细胞之间出现间 隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。吸去胰酶，加入含血清培养液，摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。因为血清可以终止胰酶的消化。然后吹打瓶底各处使

2、细胞脱 落。再分瓶补加培养液。 THP-1细胞的传代就比较简单了。可以有两种传代方法。如果镜下观察细胞状态很好，没有其它杂质即细胞裂解物之类的，就 可以采用直接传代法。传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。吸弃上层少量培养液约三分之一，将余下的培养液分成两瓶，再分别补加培养液即可。 如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。如果细胞数目较多可以低速离心约600转离心六分钟，细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂 质。如果觉得细胞数目不多比较宝贵，那就提高转速可以1000转离心六分钟，这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。离心后去除上清液，加入新 的培养液吹打浑

3、匀即可分瓶传代了。目前的方法就这些，希望对新手有所帮助/indent THP-1 细胞是悬浮细胞，相对贴壁细胞要求高一点。细胞养不好，可能的原因有，THP-1细胞特别依赖细胞浓度，ATCC上10 5到106每ML，是一个很高的密度，细胞少了就不太容易养好。1、细胞株的来源很重要，如直接来源于ATCC（American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心）生命力要强于国内细胞库的2、注意细胞的密度一定要高，介于5105 106/ML之间，增值的快。细胞数量太少，不适合THP-1生长，一般状态不好的THP-1在培养了3天后数量仍然不多，继续培养一天或者两天，培养基

4、 严重泛黄，细胞数量会巨增。这一点不同于同是单核细胞系的U937细胞。3、THP-1细胞适合在细胞ph环境偏酸环境生长，对培养基变化非常敏感，所以 尽量使用相同ph的1640，4、还要注意，传代后切忌常移出培养箱观察，否则会影响细胞生长，状态变差，一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般THP-1 生长相当快，对于状态已经不好的情况，建议传代后34天再观察，一般4天时间培养基已明显泛黄，细胞数量巨增。1)THP-1细胞喜欢酸性条件，你不要 老是换培养基。越酸的条件，细胞密度越大，细胞就长得越好。2） 不要频繁换液，一般2-3次换液离心一次（只是补充培养基）3） 使用1640（ATCC推荐），注意加碳

5、酸氢钠2.5g就可以了，宁酸勿碱 4） 注意冻存的时候密度大些，推荐用血清冻存5）感觉Hyclone的血清比较好6）复苏比较慢，建议开始用小瓶，不要用一次性的聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞【试剂及配制】（1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为1.0770.0001。（2） 台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml，1500r/min 离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。（3） HBSS或RPMI-1640液【操作方法】（1） 采集静脉血若干ml(随需要而定),注

6、入盛有肝素的无菌小瓶中(每1ml全血用0.1ml 125250U/ml肝素溶液抗凝),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝；（2） 用吸管加入等体积的室温HBSS或PBS,使血液等倍稀释,可降低红细胞的凝聚,提高分离效果（此步骤亦可省去）；（3） 吸取淋巴细胞分层液(每10ml稀释血加5ml分层液)置于15ml或50ml离心管中,然后将离心管倾斜45角,将稀释血液在距分层液界面上1cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面(亦可将吸管嘴插入离心管底部,将分层液缓慢加在稀释血液的下面),应注意保持两者界面清晰,勿使血液混入分层液内；（4） 将离心管置水平式离心机内,在1820下,以2，000r/min离心20m

7、in。离心后,管内可分为以下四层:上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。见图1。Ficoll-Hypaque离心法分离血液成分（5） 用毛细吸管轻轻插入灰白色层,沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞,盛入另一支离心管中;或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板,再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞。既要尽量吸取所有单个核细胞,又要避免吸取过多的分层液或血浆,以免混入其他细胞成分；（6） 将所得到的PBMC悬液用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次,依次以2，000r/min、1500r/min在室温下

8、(1825)离心10min,可去掉大部分混杂的血小板；（7） 用完全RPMI-1640定容细胞,计数细胞后再调整细胞所需浓度。一般每ml健康成人血可分离出11062106个单个核细胞；（8） 用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性:取2滴细胞悬液加1滴2台盼蓝染液,510min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色,死细胞染成蓝色。计数200个细胞,计算活细胞百分率,一般活性应在95以上。【注意事项】（1） 与血液样品接触时应注意生物安全防护,避免血源性传染病。 （2） 操作应轻柔,细胞悬液应充分混匀,避免损伤细胞活性及细胞丢失。 （3） 细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一,最适密度在室温下应为1

9、.0770.001g/L;应避光4下保存,取出后逐渐升至室温后混匀,方可使用;使用中应避免细菌污染。（4） 稀释血液可降低红细胞的凝聚,提高淋巴细胞收获量,但如果要保留血浆成分作其它实验用时,则不能稀释血液,以免影响血浆成分。（5） 离心时的温度对分离效果亦有影响,温度过低,离心时间需适当延长,淋巴细胞丢失增多;温度过高,增加红细胞凝聚,且影响淋巴细胞活性.离心时最适温度为1820。（6） 若从未抗凝血中分离单个核细胞,可先用链激酶溶解血凝块,然后再按上述方法分离。（7） 分离组织中的单个核细胞亦可采用上述方法。高密度淋巴细胞分离液的配制及其应用市售淋巴细胞分离液密度为1.0770.002 g

10、/m1,适于人外周血淋巴细胞的分离。小鼠脾淋巴细胞的分离应使用密度为1.088 g/m1的淋巴细胞分离液。国外已有该分离液出售,但目前国内尚无供应。我们用聚蔗糖(Ficoll 400)和泛影葡胺(Hypaque)将市售淋巴细胞分离液的密度调至1.C89g/ml,用于小鼠脾淋巴细胞分离,取得了满意的效果。 材料和方法 淋巴细胞分离液(P=l,哪9 g/m1)的配制 量取40Ficoll 400溶液(上海试剂二厂)72 m1,泛影葡胺注射液(北京第三制药厂)25.3 ml,双蒸水72.7 ml,混匀后加入密度1.077g/m1的淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)340 m1,再混匀。司P20用比重天平

11、测其密度;用冰点渗透压计测定渗透压两次,取平均值。抽滤除菌后分装,每瓶6 ml,低温保存。 小鼠脾淋巴细胞的分离雄性BALB/e小鼠,1620周龄,体重1418 g,摘除眼球放. 阅读(103)评论(0)编辑删除 酸性-醋酸萘酯酶染色法-转载一、原理 T淋巴细胞质内含有酯酶，可以水解-醋酸萘酯，产生-萘酚，-萘酚又可与重氮付品红偶联生成不溶性的偶氮付品红萘酚，在T淋巴细胞浆酯酶存在的部位生成不溶性的黑红色的颗粒沉淀，而B淋巴细胞无此反应。以资鉴别。 二、材料与试剂 1固定液40%甲醛 (可用2.5%戊二醛代替)2分层液（聚蔗糖泛影葡胺）比重1.077+0.001，配制见细胞分离技术一章。 聚蔗

12、糖泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成401%(W/V)水溶液,也有干粉出售.应用时,用蒸馏水配制9%溶液.泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1去氧甲氨基山梨醇.含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影.应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺. 1.0770.001聚蔗糖泛影葡胺的配制: 9%聚蔗糖液 24份 33.9%泛影葡胺液 10份混合即可.必要时,

13、可测比重.需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3高压灭菌15min,4保存.一般可保存3个月. 如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算: 式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积.如需配制1.077比重的聚蔗糖泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为10046.3. 3染色液 （1）副品红液：取2g副品红加入2NHCl100ml,温水浴溶解后保存于4备用。 （2）亚硝酸钠溶液（现用现配）：取0.14g亚硝酸钠加入双蒸馏水10ml，振荡溶解。 （3）-醋酸萘酯溶液：取2g-醋酸萘酯溶于乙二醇单甲醚（可

14、用丙酮代替）100ml中，贮于棕色瓶内，于4保存。 （4）0.067Mol/LpH7.6PB液 甲液KH2PO49.08溶于1000ml双蒸馏水 乙液KH2PO49.47g溶于1000ml双蒸馏水 （6）甲基绿复染液：取1g甲基绿，溶于100ml双馏水中，4保存。 （7）应用染色液（孵育液）的配制取1ml亚硝酸钠溶液缓慢滴入1ml的付品红液中，边加边摇匀，付品红液由红色变为浅黄色，混合后，静置1min2min，将此混合液倒入30mlpH7.6PB液中，充分混合后，再加入-醋酸萘酯溶液0.85ml，边加边搅拌，混匀后使用。 三、操作方法 1标本的制备取肝素抗凝血1ml，加等量或适量的生理盐水稀释

15、，取分层液2ml加入离心管内，然后将上述稀释的血液沿管壁缓缓加入至分层液上，注意不要打破两层界面。以水平转子离心机10001500r/min离心20min。结果形成四层，最上面第一层为血浆层，第二层为淋巴细胞（包括单核细胞）层，第三层为分层液，第四层为红血球。用毛细管吸取血浆层，然后吸取淋巴细胞放入适量的Hanks液（或生理盐水）中，充分摇匀。2000r/min离心5min10min弃上清液，再重复洗涤一次，即获淋巴细胞。以此淋巴细胞粥涂片。自然干燥后，以40%甲醛蒸汽固定10min。 2染色镜检 （1）于固定的标本片上滴加孵育液，以覆盖为度，37染45min60min，蒸馏水冲洗。 （2）甲

16、基氯复染1min5min，蒸馏水冲洗。 （3）自然干燥，镜检。四、结果判定 在胞浆内出现大小不一、数量不等的黑红色颗粒的细胞为T淋巴细胞，无此颗粒的为B淋巴细胞。同时计数淋巴细胞100200个。求出它们各占的百分比。 几种动物的T淋巴细胞正常值 马57.8+2.009% 骡51.8+2.037% 小白鼠76.42+4.44% 豚鼠73.43+8.04% 兔77.0+2.79% 人62.3+8.62% 五、注意事项 1本试验对染色剂的pH值要求比较严格否则不易染上。染色时间在各动物也不一致，见表19-1。 表19-1人与几种动物酯酶染色的最适pH值与染色时间有人主张孵育液的pH值必须在.5.86

17、.42固定液可用2.5%戊二醛代替甲醛，据认为其效果更好，标本清晰，颗粒鲜明。固定方法为4固定10min，然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。制片后迅速固定，以免细胞死亡破裂，酶外溢，造成假阴性。3所用试剂必须要纯品，最好是AR级。所有器皿必须洗净，用蒸馏水冲洗，且专用。4有人认为用碱性品红可代替品红，丙酮可代替乙二醇单甲醚，孔雀绿可代替甲基绿。5酯酶染色法与E-玫瑰花环的关系：有人认为，酯酶染色法可以代替E-玫瑰花环试验，至少两者应相应一致抗体ProteinA纯化方法ELISA叠加试验检测单克隆抗体的抗原结合位点免疫方面的网址 体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条

18、件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取4-8周龄 BALB/c 小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤2-3次 ，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原（可溶性抗原0.5- 5ug/ml，细胞抗原105-106个细胞/ml ）和一定量的 BALB/c 小鼠胸腺细胞培养上清液；在37，6%CO2浓度下培养3-5天，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。鼠抗人淋巴细胞表面抗原单克隆抗体为法国Immunotech产品，FITC标记抗鼠IgG为法国Immunotech产品，绵羊血液由青岛医学院动物实验室提供。1.0770.001聚蔗糖泛影葡胺的配制： 9聚蔗糖液

19、24份 33.9泛影葡胺液 10份 混合即可骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%20%，细胞浓度以1045105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：31：10的比例传代。每35天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性杂交瘤细胞的克隆化：1有限稀释法克隆（1）克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。2）将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。（3）调整细胞为310个细胞/ml。（4）取头天准备的饲养细胞层的细胞培

20、养板，每孔加入稀释细胞100l。孵育于37、5%CO2孵箱中。（5）在第7天换液，以后每23天换液1次。（6）89天可见 细胞克隆形成，及时检测抗体活性。（7）将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。（8）每个克隆应尽快冻存。1杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则可因上述意外而前功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改

21、变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以装一支安瓿冻存。细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0后放入-70超低温冰箱，次日转入液氮中。也可用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。2细胞复苏方法 将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。 人淋巴细胞的培养

22、六MTT液的配制将MTT用Hanks液配制为200 g/mL，用0.22 m针头过滤器过滤。七不同质量浓度的PHA和Con A对 淋巴细胞转化的影响在完全培养液M1640培养液中含15%小牛血清的培养基进行培养。用96孔培养板，实验分共7组，每组12孔，PHA的质量浓度为0（对照组）、5、10、15、20 、50、100 g/mL, Con A 浓度为0（对照组）、2.5、5、10、20、30 g/mL，共6组， 在20条件下，每24 hr吹打细胞一次，培养68 hr后，弃去上清液，加入MTT溶液（200 g/mL）200 l，再在生化培养箱中培养4 hr，然后加入二甲基亚砜500 l，在波长

23、为570 nm的酶联免疫检测仪测OD570值。八不同体积分数的小牛血清对 淋巴细胞转化的影响实验组共分7组，每组转化因子PHA的最终浓度为10 g/mL，小牛血清的体积分数为0、5%、10%、15%、20%、25%、30%，其他条件同上，72 hr后测OD570值。九不同温度对 淋巴细胞转化的影响在PHA10 g/mL，15%小牛血清条件下，细胞分别放置在15、20、25、30和 37培养箱内培养，其他操作同前，72 hr 后测OD570值。淋巴细胞分层液的制备：淋巴细胞分离液，可以配置几种不同密度的分离液，摸索最适分离淋巴细胞的比重。滴加6%Ficoll-400至比重为1.070，1.075

24、。滴加75复方Urographin至比重为1.080， 1.082，1.083，1.085，1.090 。(不 同 比重 的细胞 分 离液 ： 将 通用 型细胞 分 离 液 L T S 1 1 3( 比重 1 1 1 3 )按 厂 商说 明书要 求 加 不 同体 积 比 的 P B S ( 1 0 0 m m o l L ，无 c a 、 M g离 子 ， p H 7 2 ) ， 配 成 比 重 为 1 0 7 7 、1 0 8 0 、 1 0 8 5 、1 0 9 2 、1 1 1 0 的 细 胞 分 离 液)0 2 的 台盼蓝 染液 ： 用上 述 的 P B S 配 制淋巴细 胞 R P

25、M I 1 6 4 0培 养 液 ： 先 配 制 成 不 完 全R P M I 1 6 4 0培养 液 ， 使 用 前 加入 2 0 ( 体 积 分数 ) 灭活 小 牛血清 ， 加入 青霉 素 1 0 0 g m l 和链霉 素 1 0 0 g m l P H A 和 S P A 均 用 不 完 全R P M I 1 6 4 0 培 养液 配制成 1 m g m l 的溶 液 ， 过滤除 菌 后 分 装 ，一2 0 1 2 下保 存福 尔 马林 丙 酮固定 液 ( p H 6 6 ) ： 称 取 1 0 0 m g K H ： P O 和 2 0 m gN a 2 H P O ， 先 溶 解

26、于 3 0 r n l 水 中 ， 然后 加 入 4 5 r n l丙酮 和 4 甲醛 2 5 r n l ， 充 分 混 合 后 ， 调 p H 至6 6 ， 置 4 冰箱 中保存副 品 红溶 液 ： 称 取 4 g副 品红加入 到 1 0 0 m l 2 m o l L H C 1 中 ， 水浴溶 解过滤 后置 4 冰箱 中保 存六 偶 氮 副 品红 溶 液( 临用前 配制 ) ： 取 4 亚 硝 酸钠 溶 液 3 r n l ， 慢 慢滴入 3 r n l 副品红 溶液 中 ， 边 滴边 摇 ， 充分 振荡 1m in2 a 醋酸 萘酯溶 液 ： 称取 2 g a 醋 酸萘 酯溶 于 1 0 0 m l 乙 二醇单 甲醚 中 ， 置 4 避 光保存A N A E孵育 液 ( 临用前 配 制 ) ： 取 1 0 0 m m o l L ， p H7 6 磷酸 盐缓 冲液 8 9 r n l ， 加入 染色 缸 中 ， 缓缓 加入六 偶氮 副 品红液 6 m l ， 充 分 混匀 后 再慢 慢 滴入 2 a 醋酸 萘酯 溶液 2 5 r n l ， 充分 混 匀 后 ， 调D H至 6 1 。2 甲基 绿 染 色 液 ： 取 甲基 绿 2 g ，溶 解 于 1 0 0 m l 热 蒸馏 水 中 ， 溶 解 后 4 保 存 备用 。 流式细胞仪：