荭草不一样药用部位抗心肌缺血作用及化学成份比较研究

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1、荭草不一样药用部位抗心肌缺血作用及化学成份比较研究 黄勇，郑林，王爱民，兰燕宇，李勇军，何迅，王永林摘要 目标针对荭草对心血管方面的作用，确定荭草药材的药用部位。方法以大鼠和家兔为试验动物，采取结扎冠脉造成急性心肌缺血和离体心脏冠脉流量灌注模型，分别观察荭草各部位(全株、根及粗茎、带叶茎枝、花穗)对上述试验模型心电图、心肌梗塞范围和冠脉流量的影响;同时对不一样药用部位化学成份(异荭草素、荭草素和原儿茶酸)及其指纹图谱进行测定，以探讨荭草对心血管作用的物质基础。结果荭草全株、带叶茎枝、花穗均能不一样程度改进缺血心肌心电图，使缺血范围降低;可显著增加离体心脏的冠脉流量。其中带叶茎枝和花穗的综合作用

2、较优，而根及粗茎最弱。不一样部位异荭草素、荭草素和原儿茶酸的含量均展现相同趋势：带叶茎枝花穗根及粗茎;指纹图谱亦显示不一样药用部位的特异性差异。结论荭草的带叶茎枝和花穗可能是心血管疾病诊疗的有效药用部位，而且其中异荭草素、荭草素等化学成份的多寡和药效强度含有一定相关性，可为药材的临床应用和质量控制提供依据。关键词 荭草;药用部位;心肌缺血;化学成份Abstract：ObjectiveTo find out the effect of medicinal parts of Polygonum orientale on cardiovascular disease.MethodsThe model

3、s of acute myocardial ischemia induced by ligating coronary artery in rats and coronary artery flow(CF) in isolated heart of rabbits were applied. The effects of different medicinal parts(including the whole plant,root main stem,branch with leaves, ear) on the ECG, the infarct sizes and CF of heart

4、were observed.The contents of chemical constituents(isorientin, orientin,protocatechuic acid) and HPLC fingerprint were determined in order to find out the substance basis in cardiovascular disease respects.ResultsThe extracts from whole plant,root main stem,branch with leaves and ear of the plant c

5、ould improve the change of ECG, decrease the range of myocardial ischemia and increase the CF to varying degrees. The samples of branch with leaves and ear showed more comprehensive effect, while the ones of root and main stem did poor. Contents of isorientin, orientin and protocatechuic acid of dif

6、ferent medicinal parts showed the same tendency: branch with leavesearwhole plantroot main stem.The HPLC fingerprint also reflected distinctive characteristic of the different parts.ConclusionThe branch with leaves and ear of Polygonum orientale may be the effective medicinal parts on cardiovascular

7、 disease, and the intensity of pharmacodynamics is closely related to the contents of isorientin, orientin and protocatechuic acid, so these chemical constituents can provide scientific basis for clinical application and quality control of Polygonum orientale.Key words：Polygonum orientale; Medicinal

8、 parts;Myocardial ischemia;Chemical constituents荭草为蓼科植物荭蓼Polygonum orientale L. 的干燥全草，生于路旁和水边湿地，分布较广，含有祛风利湿，活血消肿的功效，用于诊疗风湿性关节炎、冠心病、疝气等1。据中华本草中药大辞典等记载2，3荭草的茎叶、果实、根和花均可作为不一样部位入药，而且功效主治有所差异。而据当代药理学研究表明，以单味荭草制备的注射液有广泛的心血管系统药理活性，如增加心肌营养血流量及冠脉流量，改进急性心肌缺血缺氧状态，同时能降低心肌耗氧和提升机体在低氧状态下的氧利用能力;减弱离体心脏的收缩力和心率，能使外周血管

9、扩张，血压轻度下降等4，5。贵州荭草丰富，民间将其用于诊疗胸痹心痛，心胃气痛，但用药部位较为混乱。所以，为了更加好地利用荭草的药用价值，有效开发药材，本研究采取试验性大鼠心肌缺血、兔离体心脏冠脉流量灌注试验对比考察了荭草不一样药用部位的药效强度;化学成份研究的结果表明荭草关键含黄酮类和酚酸类成份6，依据文件710本研究对荭草不一样部位中黄酮类成份异荭草素和荭草素、酚酸类成份原儿茶酸测定了含量，同时考察了各部位的HPLC指纹图谱，以期找到化学成份同心血管方面作用的有效部位之间的相关性，为其在心血管方面的临床应用提供试验研究依据。1 仪器和材料1.1 仪器岛津LC10 A系列高效液相色谱仪;WML

10、色谱工作站，南宁威玛龙色谱科技有限企业产品;心电图仪，日本NIHON KOHDEN企业产品;DH140人工呼吸器，浙江医科大学医学仪器试验厂产品。Langendorff法灌流装置。1.2 药品和试剂荭草Polygonum orientale L.产地：贵州省惠水县，采收期9月。由贵阳医学院药品研究所生药学研究室龙庆德副教授判定。复方丹参注射液，上海通用药业股份有限企业第三企业产品;异荭草素和荭草素对照品是从荭草中分离、纯化而得，经NMR、MS判定为异荭草素、荭草素(另文报道)，HPLC归一化法测定其纯度均在98%以上;原儿茶酸对照品(药品生物制品检定所)。硝基四氮唑蓝(NBT)，上海前进试剂厂

11、产品。1.3 动物 SD大鼠，体质量250300 g;家兔，体质量 22.5 kg;雌雄兼用，由贵阳医学院试验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)20210001。2方法2.1 样品制备取荭草各药用部位(全株、根及粗茎、带叶茎枝、花穗)，水煎煮提取浓缩后65%乙醇沉淀，滤液浓缩，加水微热溶解，调pH至6，滴加明胶溶液至无沉淀产生，再加乙醇使含醇量达75%，静置，滤过，回收至近干，以注射用水稀释至每毫升含2 g生药，调pH值至7，煮沸，滤过，冷藏24 h，用0.45 m微孔滤膜滤过，滤液分装，灭菌，备用。各药用部位样品分别记为A组、B组、C组、D组。2.2 剂量设置 依据贵州省中药材、民族药材

12、质量标准(2021 年版)荭草用药剂量和预试验药效学结果，设定了本试验剂量方案。2.3抗试验性心肌缺血试验112.3.1 对大鼠急性心肌梗塞心电图的影响 取雄性SD大鼠，随机分为6组，分别为模型对照组，阳性对照组(复方丹参)，样品A(全株)组、B(根及粗茎)组、C(带叶茎枝)组、D(花穗)组。动物用10%乌拉坦麻醉，固定，将针形电极插入四肢皮下，连接心电图机，统计正常肢体导联心电图。打开胸腔前接上人工呼吸机，各组动物结扎左冠状动脉前降支后，快速关闭胸腔，恢复呼吸，统计心电图，有显著J段抬高或压低者为手术成功征象(剔除未出现显著心肌梗塞心电图波形者)。结扎后马上分别股静脉给药，模型组给等体积生理

13、盐水。统计结扎后5，15，30，60，120 min各时间点心电图，计算各时间J点上下偏移mV数。2.3.2 对大鼠急性心肌梗塞范围的影响 试验结束后，立刻取出心脏，用生理盐水洗净余血，剪去心房及各大血管、筋膜、心耳等，称取心室重量，然后将心肌切成等厚度的5片，置于37 0.5%NBT染色液中染色10 min，取出剪去被染色的非梗塞心肌，称重未染色的梗塞区心肌，以重量法计算心肌缺血区百分率。2.4对离体兔心冠脉流量的影响11取家兔，雌雄兼用，击后脑致昏，快速开胸取出心脏，按Langendorff法主动脉插管，心脏固定在灌流装置上后，用恒温38 0.5 且不间断通入纯氧的RingerLocks液

14、灌流，灌流压恒定为50 cmH2O。待灌流稳定后，采取交叉给药法，分别由灌流侧管注入供试药液，观察统计给药前、后1 min的流量值。2.5 异荭草素、荭草素和原儿茶酸含量测定 参考文件7，8方法，采取高效液相色谱法测定药材各部位上述指标。测定异荭草素、荭草素色谱条件：Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm250 mm，5 m)，流动相乙腈0.1%磷酸水溶液(1882)，流速1 mlmin1，柱温40，检测波长350 nm;测定原儿茶酸色谱条件：Hypersil C18色谱柱(5 mm250 mm，5 m)，流动相甲醇水(1090)，流速1 mlmin1，柱温40 ，检测波长258 nm

15、。2.6 HPLC指纹图谱测定 参考文件方法9，10，采取高效液相色谱法测定药材各部位指纹图谱。色谱条件为：色谱柱Inersil ODS3柱(4.6 mm250 mm，5 m，日本GL Sciences Inc.);流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸，梯度洗脱：0 min45 min，A(13%21%);45 min60 min，A(21%33%)，柱温35 ;流速1 mlmin1;检测波长 300 nm。2.7 数据统计处理 数据以s表示，采取Studentst检验。3结果3.1 对急性心肌梗塞心电图及梗塞范围和对离体心脏冠脉流量的影响模型组动物心电图出现显著波形改变，J点异常改变，心肌缺血程

16、度连续加重。各药品组除荭草的根及粗茎样品组外，其它各组不一样程度改进缺血性心肌心电图，使心肌缺血区的百分率降低，对急性心肌梗死有显著的保护作用，和模型对照组比较差异含有显著性(P0.05或P0.01);在对离体心脏冠脉流量的实验研究中，全株、带叶茎枝和花穗增加冠脉流量的作用最为明显(P0.05或P0.01)，同样根及粗茎效果不理想。综合两项药效学实验结果，荭草带叶茎枝和花穗是改善急性心肌缺血状态和心脏血液供应的有效部位。见表13。表1对大鼠结扎左冠状动脉前降支后ECG的影响表2对急性心肌梗塞范围的影响表3对离体兔心冠脉流量的影响3.2 荭草药材不一样部位异荭草素、荭草素和原儿茶酸的含量 荭草不

17、一样药用部位异荭草素、荭草素和原儿茶酸的含量有显著性差异，以茎枝和叶的含量最高，根和粗茎仅含有少许异荭草素，几乎不含荭草素和原儿茶酸。结果见表4。表4荭草药材不一样部位含量测定结果3.3 荭草药材不一样部位HPLC指纹图谱 各药用部位指纹图谱的差异直观而显著，根和粗茎的色谱峰较为单一，色谱峰的数量和强度全部大大少于花穗和带叶茎枝;花穗和带叶茎枝色谱图的指纹信息较为丰富，含有各自的特征性，又具有一定的相同性，提醒花穗和带叶茎枝的有着共同的物质基础。结果见图15。图1荭草药材根的HPLC指纹图谱图2荭草药材粗茎的HPLC指纹图谱图3荭草药材花穗的HPLC指纹图谱图4荭草药材带叶茎枝的HPLC指纹图

18、谱图5荭草根、粗茎、花穗、带叶茎枝不一样部位指纹图谱中关键峰峰面积棒状图4讨论在体情况下，心脏功效受前负荷、神经体液等原因的影响，极难评价药品对心脏的直接作用，所以本研究以Langendorff离体心脏冠脉灌流量试验，采取兔离体心脏模型比较观察了荭草不一样药用部位对冠脉流量的影响。Langendorff法是筛选心血管药品的常见方法，常使用大鼠或豚鼠，但动物心脏太小操作不便且稳定性和反复性较差，本研究采取兔为试验对象，结果稳定、反复性好。依据文件报道，荭草素在舒张血管平滑肌，保护急性缺血在体模型心肌、降低整体动物的心肌耗氧及增加心肌供血等方面1214对心血管系统含有广泛的药理作用;原儿茶酸含有降

19、低心肌氧耗、缓解心肌局部缺血的作用，在诊疗心血管疾病方面也有良好的活性15，故在选择含量测定的指标成份时，既考虑荭草在心血管方面的应用，又兼顾药材中极性差异较大的黄酮类成份和酚酸类成份，确定了含量相对较高而化学性质稳定的荭草素及同系物异荭草素和原儿茶酸，尽可能使测定的指标成份和药材药理活性一致。本研究采取药效学试验结合化学指标成份及指纹图谱综合分析的方法，对贵州产药材荭草的根及粗茎、带叶茎枝、花穗等不一样药用部位进行了比较研究。本研究表明，在心血管作用方面带叶茎枝和花穗含有很好的药理活性;理化性质研究的结果显示带叶茎枝和花穗中黄酮类化合物和有机酸类的含量较高，而根及粗茎中黄酮类化合物和有机酸类

20、的含量极低，提醒黄酮类化合物和有机酸可能为荭草的有效成份群;指纹图谱信息量的差异亦从更广泛的意义上反应了各药用部位物质基础共性和个性的关系。本研究的后续工作将放大样本量，更深入、系统地比较荭草中黄酮和有机酸类成份在不一样药用部位的分布及不一样产地、采收季节等原因对其产生的影响。以上的研究工作，将为临床荭草药材的使用是否区分部位或地域提供科学的依据。参考文件 1贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准S.贵阳:贵州科技出版社, 2021: 267. 2中华本草编委会，国家中医药管理局. 中华本草，第2册M.上海: 科学技术出版社,1999:681.3江苏新医学院.中药大辞典，下册M.

21、上海：上海科学技术出版社,1986:1617.4郑兴中,倪峰,王碧英,等. 荭草对心血管的作用的研究J. 福建医药杂志,1984,6(6):28.5四十四医院荭草研制组.86铷(86Rb)测定荭草对小鼠心肌营养性血流量的影响J.贵州医药，1981,5:70.6李勇军,何迅,刘丽娜,等.荭草化学成份的研究J.中药杂志,2021,30(6):444.7王爱民,王永林,刘丽娜,等.荭草药材的质量研究J.中药杂志,2021,31(13):1047.8周雯,刘丽娜,兰燕宇,等.反相高效液相色谱法测定荭草中原儿茶酸的含量J.贵阳医学院学报,2021,32(1):59.9王爱民,王永林,兰燕宇,等.荭草药材

22、指纹图谱的研究J.中成药,2021,28(1):5.10黄勇,郑林,王爱民,等.贵州产荭草药材指纹图谱的模式识别研究J.中成药,2021,30(7):945.11徐叔云,卞如濂,陈修.药理试验方法学，第3版M.北京:人民卫生出版社,2021: 986,1052.12付晓春,李少鹏,王敏伟.荭草苷对离体家兔主动脉平滑肌的舒张作用及其机制J.药科大学学报,2021,37(6):539.13付晓春,黄智璇,蔡岳文,等. 荭草苷对犬试验性心肌梗死的影响J.医药导报,2021,25(7):621.14付晓春,杨群华,黄智璇,等.荭草苷对麻醉犬心功效和血流动力学的影响J.华西药学杂志,2021,22(3):289.15孙文基,绳金房.天然活性成份简明手册M. 北京:医药科技出版社,1998:464.