斜面低温保藏法

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1、斜面低温保藏法此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法操作简单，使用方便，不得特殊设备， 操作时，将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2-8C冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有所不同，霉菌、放线菌及芽 胞的菌保存 2-4 个月，移种一次；酵母菌两个月移种一次，细菌最好每月移种一次。此法 的缺点是菌种容易变异， 因为培养基的物理、 化学特性不是严格恒定的， 传代过多会使微生 物的性状和代谢发生变异，在传代过程中，污染杂菌的机会也较多。因此，此法仅能用于工作用菌种的短期保藏， 并应随时检查其污染杂菌和变异等情况， 传代代数超过 5 代的菌种应 灭菌处理后抛弃。xxx 食

2、品检测中心作业指导书1. 目的 规范实验室菌种的收集、使用、保管程序；确保实验室的安全。2. 范围 本管理细则适用于实验室菌种的使用和管理。3. 职责3.1 菌种保管员：按照本指导书做好菌种的收集、转种、使用、保存和发放以及销毁工作。3.2 科室负责人：负责监督菌种的使用及管理。4. 管理细则 本实验室保存的菌种仅包括一部分致病性较弱的三类细菌、 一部分无致病能力的普通细菌和 常见真菌。不包括病毒、螺旋体、衣原体、立克次体；保存的菌种主要用于各类培养基、检 测试剂的性能测试和质量控制。4.1 在本实验室保管的菌种名4.1.1 保留工作菌种：大肠杆菌 ATCC25922 、鼠伤寒沙门氏菌 500

3、13 、福氏志贺氏菌 2a ATCC12022、副溶血性弧菌 200904-1、金黄色葡萄球菌 ATCC25923、表皮葡萄球菌 ATCC12228 溶血性链球菌 23310、铜绿假单胞菌 10211、普通变形杆菌，克雷伯氏杆菌，小肠 结 肠 炎 耶 森 氏 菌 ATCC 23715 、 单 核 增 生 李 斯 特 菌 ATCC19111 、 枯 草 芽 胞 杆 菌ATCC6633b、蜡状芽胞杆菌 ATCC11778、白色念珠菌 ATCC10231、酿酒酵母 ATCC9763、黑 曲霉菌 、展青霉菌 、 黄曲霉菌。4.1.2 常规检测 ,科研分离得到的有保留价值的三类 /四类菌种根据需要可继续

4、保留； 如果在食 品中分离到二类 /一类菌种 ,及时送上级单位进一步鉴定 ,并按规定立即销毁。 本实验室不保存 一类、二类菌种。4.2 菌种的保管4.2.1 实验室菌种保存于专用的菌种室。4.2.2 菌种保管员及科室负责人双人双锁负责保管菌种。4.2.3 使用菌种需提出申请、经科室负责人批准后，向菌种保管员领用。4.2.4 菌种应按规定的时间定期转种，一般每转种 3 代做一次鉴定，如发现污染或变异应及 时处理。4.2.5 保管人员工作变动时应作好交接工作。4.3 菌种的使用和保存4.3.1 菌种的类别4.3.1.1 实验室内的标准菌种根据用途不同，分为储存菌种、传代用菌种和工作用菌种。 储存菌

5、种： 以冷冻干燥保藏为主， 用于菌种的长期保存， 一般是从菌种保藏中心或专业实 验室购买得到的标准菌株，用符号 S 表示。一般可保存 5 年。 传代用菌种： 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法， 用于菌种的传代， 用符号 G 表示。甘油冷冻管保藏法一般可保存 2 年； 工作菌种：保存于半固体内或琼脂斜面培养基中，作为工作用菌种，用符号W表示。一般可保存12个月。431.2实验室从样品中分离得到的菌株用符号Y表示。4.3.2 菌种的接收菌种购到实验室后， 应在菌种接收记录上填写所购菌种的信息， 如名称、数量和接收日期等。 贴好标签后储存于-30 C以下。4.3.3 冷冻干燥菌种的恢复培养按

6、菌种保藏中心的要求进行恢复培养。中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC） 建议的方法如下： 安瓿管开封：用浸过70 %酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰将安瓿管顶端加热，滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂，用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。 菌株恢复培养：用无菌吸管，吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基（如营养肉汤），滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，取约 0.2ml 菌体悬浮液，移植于指定的琼脂斜 面/平板培养基上，剩余的菌液，注入指定的液体培养基内（3-4ml）,然后在建议的温度下（一般培养温度 32.5C戈.5C, 1824h）培养。 注意事项：菌种活化前，请将安瓿

7、管保存在5-10 C的环境下；某些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长。4.3.4 菌种的传代从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0代。按转种次数确定菌种的代数： 冷冻干燥的菌种在液体培养基内恢复培养（第1代）后，转种至平板培养基上得到单个纯菌落，此为第 2 代。菌种传代一般不超过5 代。 鉴定菌种后制甘油冷冻管 经菌种特性鉴定后， 挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备 甘油冷冻管，此作为第 2代传代用菌种（G2）;同时挑取纯菌落转接斜面，此菌种作为工作 用菌种，为第 3代（ W3）。 将第2代传代用菌种（G2）管冷冻保存（-30 C以下），将第3代工作用菌种（

8、W3）以适 当温度下培养适当时间后可用于实验。 取一支冷冻保存的第 2代传代用菌种（G2）转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种 制成甘油冷冻管，为第 3代传代用菌种（G3）;斜面培养基经适当温度下培养适当时间后可 用作第 3 代工作用菌种（ W3）。 当工作用菌种代数小于 5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如W3可直接转接为 W4。 按上述程序操作，直至 G4转为W5为止，需重新开启安瓿，再重复上述操作程序保藏和 使用菌种。4.3.5 菌种的保存方法4.3.5.1 甘油冷冻管保存法 甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种，一般可保存 2 年。 将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜

9、面，经37C 2448h培养后，用无菌接种环轻轻刮取菌苔， 移至预先装有无菌蒸馏水的试管中， 调整菌液浓度， 使其等同于 1 单位麦氏比浊管。 向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。 轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装于无菌小试管中，在-30C条件下贮存。4.3.5.2 液体石蜡覆盖保藏法 液体石蜡覆盖保藏法适用于保存传代用菌种，一般可保存 3-6 个月。 取纯化菌种穿刺接种于半固体培养基中，经37C 1824h培养后，加无菌液体石蜡覆盖半固体表面（高度 1 厘米为宜）。 石蜡油封存以后，放入 4C冰箱中保存，也可直接放在低温干燥处保藏。肠道细菌

10、、葡 萄球菌一般可保存 3-6 个月；保存 O1 群和非 O1 群霍乱弧菌时宜放置室温阴暗处；保存副 溶血性弧菌时，用含 3.5%氯化钠半固体，宜放置室温阴暗处；保存葡萄球菌、链球菌可用 10%血半固体。4.3.5.3 斜面低温保存法斜面低温保存法适用于保存工作用菌种，一般可保存1 2 个月取纯化菌种转接种于适宜的固体斜面培养基上，经37C 1824 C培养后，用纸将管塞部分包扎好，放入4C冰箱中保存，也可直接放在低温干燥处保藏。4.4 菌种的实验室编号编号原则：菌种名称 +类别/传代次数-制备日期或接收日期，例副溶-G3-20081213。对于实验室从样本中分离得到的菌种，类别用 Y 表示，

11、例副溶 -Y3-20081213 。注：菌种名称使用中文简称，如 “副溶血性弧菌 ”用“副溶”表示； “金黄色葡萄球菌 ”用“金葡” 表示； “奇异变形杆菌 ”用“奇变 ”表示。4.5 菌种的销毁4.5.1菌种销毁采用高压蒸汽灭菌：121C, 20分钟。4.5.2下列菌种需及时销毁处理：发生污染或变异的菌种；超过保存期限的菌种；使 用后的菌种。5. 记录表式 菌种接收记录表 菌种使用登记表 菌种销毁审批表6. 参考文献6.1 戴光强 医学继续教育系列丛书 ?卫生检验分册 M 合肥：安徽科学技术出版社，2001.46.2 管远志， 王艾琳，李坚管医学微生物实验技术 M 北京：化学工业出版社，200586.3 王宏明微生物检验技术操作规程与质量控制及检测数据分析处理实用手册M 北京：卫生科技出版社， 2007.5