免疫血液学实验的质量控制

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1、1 广州血液中心 汪 传 喜 2 2006年卫生部颁布的血站实验室质量管理规范对血站免疫血液学实验提出了具体要求。许多因素会影响免疫血液学实验结果：仪设备器（离心机、冰箱、孵育箱、加样器）；检验试剂（定型血清、标准细胞、其它试剂）；实验方法（实验的选择、对照实验、环境）；实验室相关文件（标准操作规程、标记、登记、记录、报告）等影响。如何对相关因素进行控制以保证实验结果的准确性和可靠性，对免疫血液学实验具有重要意义。31.对血液免疫血液学检测项目、方法和结果的判定标准如下：ABO血型鉴定，检测方法为直接血凝试验，检测结果以正反定型相符合方可确定其血型。如正反定型不符，应作进一步试验。ABO亚型鉴

2、定，检测方法为直接血凝试验、血凝抑制试验、吸收放散试验，根据病史和以上试验结果，确定被检者血型。4RH系统血型鉴定，检测方法为直接血凝试验或抗人球蛋白试验，检测结果以呈凝结反应为阳性，无凝结反应为阴性。RH(D)阴性确认，检测方法为血凝试验、抗人球蛋白试验，以三个不同克隆株或不同人的IgG抗D血清进行检测，全部不凝为RH阴性，部分凝结为D变异型。5抗体筛选和抗体鉴定，检测方法为直接血凝试验、抗人球蛋白试验、聚凝胺试验。检测结果呈无凝结反应，为抗体筛选阴性，反之，抗体阳性。并确定其特异性。交叉配血，检测方法为直接血凝试验、抗人球蛋白试验、聚凝胺试验。检测结果呈无凝结、无溶血反应为配合。62.对血

3、液免疫血液学检测项目，应使用不同厂商生产的试剂，对每项试验均要作阴阳性对照。3.实验室的基本设备应包括离心机、水浴箱、显微镜、各种冷冻冷藏设备及其他专用设备。集中化检测实验室应配备与其功能相适应的检测设备。应对实验室的关键设备进行确认，定期校准和维护。74.建立和实施试剂的管理程序，包括：4.1试剂的评估程序，包括生产商和供应商的（国家规定的相应）资质，试剂的技术要求。4.2试剂的确认程序，包括实施确认的人员、方法、质量控制方法、接受标准、每批试剂投入使用前应进行确认。4.3试剂的库存管理程序，应包括试剂的贮存条件和库存量的监控，试剂应在有效期内使用。85.建立和实施实验室内部质量控制程序，其

4、基本要求如下：5.1 在每次试验时，观查试剂是否有不正常外观，包括试剂红细胞有无明显的溶血或混浊：血清试剂无沉淀物和颗粒或胶状物形成。5.2 在每项试验中，注意试剂敏感性和特异性：ABO正定型阴阳性对照细胞反应需清晰明确：反定型与抗A、抗B（抗AB）反应需清晰。5.3 RH(D)血型试剂与已知的阳性和阴性质控细胞反应清晰。5.4 抗人球蛋白试验质控细胞与抗人球蛋白试剂反应有1+2，与生理盐水反应阴性。95.5 抗球蛋白试剂（抗IgG和抗C3d）应与任何ABO血型的非致敏红细胞与相容的血清孵育后无溶血和凝集反应；与被稀释的抗IgG(D)和红细胞的敏感性凝集在显微镜下可见1+2+。5.6 抗体筛选

5、和鉴定细胞（纯合子剂量效应），需用在生理盐水中反应弱的抗P和抗人球蛋白中反应1+2+的抗D来测定。5.7应实施日常的质控试验记录，包括试验的反应性，商业来源试剂的批号，试验日期和试验者的签名。106.建立对新的试剂进行检测程序，新的试剂应在常规工作中试用一周，或至少做五十份标本，包括23份ABO亚型和23份弱D抗原。7.完成检测后的血清或血浆标本，应在28的条件下保存2周。11l写一份购买写一份购买ABO血型试剂和红细胞试剂血型试剂和红细胞试剂l的步骤说明，的步骤说明，并设计试剂认证的策略并设计试剂认证的策略 12l注意：注意：试剂必须具有：试剂必须具有：特异性特异性可接受的亲和力和效价可接受

6、的亲和力和效价无污染无污染微生物检测为阴性微生物检测为阴性不引起溶血不引起溶血标准的标识识别颜色标准的标识识别颜色尽可能是单克隆尽可能是单克隆13l试剂必须标有：试剂必须标有：特异性特异性批号批号生产日期生产日期有效期有效期生产商厂生产商厂保存条件保存条件14l试剂的说明书中必须附有的其它信息：试剂的说明书中必须附有的其它信息：使用方法使用方法克隆的名称克隆的名称/编号编号使用的限制条件使用的限制条件储存标准储存标准如果需要还可以有以下的内容：如果需要还可以有以下的内容：CE/FDA的证书或相关的证书的证书或相关的证书15l说明书也要有实际运用时的考虑事项，如：说明书也要有实际运用时的考虑事项

7、，如：体积体积一滴的体积一滴的体积瓶子质地（玻璃瓶子质地（玻璃/塑料）塑料）供应和输送供应和输送如果购买试剂，需要给出派送的各个细节要求。如果购买试剂，需要给出派送的各个细节要求。相同批号的试剂至少能保证用到一年。相同批号的试剂至少能保证用到一年。161、免疫血液学实验的影响因素1.1设备包括离心机、水浴箱、显微镜、各种冷冻冷藏设备及其他专用设备。17，应使用血库专用离心机。要注意的是离心力离心转速，离心力还与转子的半径有关，标准的离心力9001000g。不同的实验要求的离心力是不同的，离心力过高，易形成亚型判断失误或假阳性 离心力/离心时间也影响实验结果：定型、各类判读结果的试验离心15秒（

8、1000g or 3400rpm）；各类洗涤细胞的试验离心60秒。离心机每六个月应校正一次，以保证其准确性。水浴箱使用的关键是控制其温度，有时其自带的温度计不准确，要另用温度计测试水温。冷藏设备要注意温度和电源，要定时记录温度，保证温度在正常允许范围。181.2 试剂试剂有：试剂抗血清抗-A,抗-B,抗-AB,抗-D；其他血型试剂；抗人球蛋白血清。试剂红细胞：A、B细胞；筛选细胞(O1,O2)，抗体筛选谱细胞，Coombs 质控细胞(IgG-致敏细胞)。反应增效剂：Liss,LIM等。19严格试剂管理程序，包括：1、试剂生产商和供应商资质，生产的技术要求。2、试剂的确认程序，每批试剂使用前进行

9、确认。3、试剂的包装和运输。4、试剂的库存管理，包括试剂的贮存条件和库存量，在有效期内使用。20 ABO和Rh(D)抗血清的最低标准(卫生部）抗血清 试验细胞 效价*亲和力(sec)Anti-A A1 128 15 A2 64 30 A2B 64 45Anti-B B 128 15Anti-D R1r（DdCcee)16 60 *无稀释血清与3相应红细胞抗原在盐水试管法3至421l 用于用于ABO反定型的试剂红细胞反定型的试剂红细胞lA 细胞细胞-与抗与抗A，抗抗A1反应反应4，与抗与抗B无反应无反应lB 细胞细胞-与抗与抗B反应反应4，与抗与抗A，抗抗A1无反应无反应lA&B 细胞细胞尽可能

10、不表达尽可能不表达M.Lewis，P1抗原抗原2213 实验方法常用的免疫血液学实验是红细胞凝集实验，包括直接凝集实验和间接凝集实验。应用于血型检测和抗体筛选、鉴定、交叉配血。不同的检测项目应选择适当的实验方法。应制定标准操作规程并严格执行操作规程。2314实验记录实验记录是免疫血液学检测的重要过程，应实时记录，不可凭想象过后补记录。242 2、免疫血液学实验质量控制内容免疫血液学实验质量控制内容任何试验必须设置对照：包括阴、阳性对照。用已知的标准红细胞或标准抗血清检测未知的血清或红细胞。只有当对照试验结果正确时，才可以判断待检测的结果。25（1）、血型检测ABO血型定型：要同时进行正反定型，

11、以互相验证。正反定型不一致时，不能判断结果，要重复试验，以查明原因。26l 处理处理:l不同批号试剂、不同技术人员分别检测，不同批号试剂、不同技术人员分别检测，l血型不一致一定要在输血前解决。血型不一致一定要在输血前解决。l *正反定型时分别用各型标准血清正反定型时分别用各型标准血清,l 标准红细胞对照比较标准红细胞对照比较l *检测分泌液检测分泌液(如唾液如唾液)中中ABH 血型物质血型物质l *用单克隆抗用单克隆抗-A,抗抗-B检测检测 McAb:特异性强；效价高；亲和力强，特异性强；效价高；亲和力强，反应速度快；易于标准化；反应速度快；易于标准化；无交叉反应；成本低，可大量生产。无交叉反

12、应；成本低，可大量生产。l *PCR检测检测l *家系调查家系调查 27血型定型差错的原因有技术性的，也有血型系统本身特性造成的。技术性错误的原因：1.血液标本弄错，张冠李戴(无样本送检与验收的SOP)282930病例病例互不相识的一女和两男因车祸而被同时送至某医院急诊室。女伤员(李某)清醒，右腿部创伤，伤口有少量出血；两位男伤员均昏迷，初步检查发现男伤员-I的下腹部有严重创伤和出血，血压低，双腿骨折；男伤员-II的头、腹部多处外伤，并大量出血，深度低血压。立即给两位男伤员输注大量晶体和胶体溶液，但低血压未能纠正，未能复苏。急诊室医师在对伤员进行急诊处理的同时，将3位伤员的血标本送血库作输血前

13、检查，分别标记为“李某”，“男伤-I”，和“男伤-II“”，申请单上要求立即检查血型，对两位重症男伤员急诊配血，输血抢救。血库立刻按要求作输血前有关检查，结果如表 31输血前血清学检查 抗-A 抗-B 抗-D A细胞 B细胞 Rh(D)血型男伤-I 4+0 0 0 4+阴性 A 男伤-II 0 0 3+4+4+阳性 0 李某 0 0 3+4+4+0 32根据有关检查及交叉配血试验结果，血库发出3U A型Rh阴性红细胞给“男伤-I”输注；3U O型Rh阳性红细胞给“男伤-2”输注。“男伤-I”创伤最重，在送到手术室时，护士发现他的导尿管中有“红色尿”流出，将此现象记录后口头通知手术医师，医师认为

14、可能是肾脏和泌尿道创伤导致“红色尿”而未重视。术中，医师注意到伤口处呈现微血管大量出血，当即给以补液、继续输血和使用升压药，但病人的血压依然过低，平均动脉压(MAP)为8kPa，体循环外周血管阻力（SVR）为410-3N/cm3，心博出量为9.8L/min。与此同时，患者体温升高，血压继续下降，经输液、输血和加用升压药以及开胸、心脏按压后，无改善，抢救无效死亡。急诊室和手术室先后取“男伤-I”的尿液和血样送检。33次日晨，“男伤-2”的身份查明，医师要求继续为其输血，血库人员对新抽血样再作检查，确认“男伤-2”为A型，Rh阳性，且在用抗-D作Rh定型时，发现有混合外观凝集现象，与上次检查结果有

15、差异。34再次血清学检查 抗-A 抗-B 抗-D A细胞 B细胞 Rh(D)血型男伤-I 0 0 3+4+4+阳性 0 男伤-II 4+0 0 0 4+阴性 A 35是什么差错?如何预防此类差错？对血样标记和处理:操作规程及核对制度对涉及输血工作的所有人员:完善的培训和再教育体系362.红细胞悬浮液过浓或过淡(未按实验操作S0P进行)3.人为标记、书写或记录错误 （无血型鉴定试验复核体系）病例：20067广州市某医院：病人红细胞 病人血清 结果 标准A血清 有反应 无反应 A型 标准B血清 无反应 无反应374.溶血现象和原因不能正确判断（未进行严格的岗位技能培训）5.未加入试剂或加错试剂（未

16、按实验操作S0P进行）6.未按照说明书操作（未按实验操作S0P进行）7.离心机校准不良或不正确使用.（仪器设置未过行核正与定期检查）8.试剂受到污染或过期（缺乏试剂的认证与日常室内质控）9.反应温度不正确（员工未进行严格的岗位技能培训）IgM 4C IgG 37C 抗A、抗B在37C条件下反应活性是4C的1/31/338非技术性错误（血型系统特性或异常病理状态）减弱或缺少的抗原反应；A或B亚型；疾病状态；过量可溶性血型物质；未知的抗原；获得性A或B抗原39（一）病例简介（一）病例简介 陈，男，66岁，因患结肠癌住院作切除手术。病人无输血史，术前备血作血型鉴定和抗体筛选检查时，发现其ABO血型正

17、、反向定型不吻合，难以确定血型，结果见表1、2。改用其它多份不同批号抗-A、抗-B定型血清和A及B试剂细胞重作检查，获得同样结果。40 红细胞正反定型血清反定型 抗-A 抗-B 抗-A，B 抗-D A1C BC 4+2+4+3+0 3+41细胞编号Rh-hrKiddLewisMNSP血清反应D C E c eJka JkbLea LebS s M NP1室温IS AHGO1+o+o +o oO2o+o+oO +o +o+o o自身 o o室温IS：为室温中细胞与血清反应后立即离心的结果；AHG为球蛋白试验结果 42ABO血型正、反向定型不吻合，问题出在红细胞正向定型还是反向定型?43 病人陈A

18、BO正、反向定型不吻合，可能是因为红细胞正向定型有问题。由表1、2结果可见，该病人的红细胞与抗A有正常反应(4+)，他的血清仅与B试剂细胞反应，没有其它意外的抗体被检测到，这表明病人的红细胞上确实存在A抗原，血清中确有抗B。然而，病人的红细胞与抗B的反应结果较预期要弱(2+)，从而推测病人红细胞上可能存在弱的B变异型，但不可能是B亚型，因为其血清中确有抗B，而病人自身对照作抗球蛋白试验结果阴性。44根据病人入院诊断和血清学检查结果，病人正、反向定型不吻合的最可能原因是什么?45 本病例正、反向定型不吻合的原因，可能是病人获得了一个“类B”抗原。在某些微生物的酶的作用下，A抗原末端的N乙酰基半乳

19、糖胺的乙酰基被切去，成为半乳糖，形成“类B”抗原。出现这类异常情况的病人，大多数有消化道疾病或者是结肠癌、直肠癌或革兰氏阴性菌感染的肠梗阻等病症。46对这类病例应如何确认其ABO血型47 两种快速的检查方法能帮助鉴定A型红细胞是否携带“获得性B结构”：用单克隆抗B血清检测病人的红细胞，大多数不与“获得性B结构”反应；将病人的红细胞酸化至pH6.0，酸化后，抗B不与“获得性B结构”的受体反应。48该类不正常情况是短暂性还是永久性的?根据“获得性B结构”的形成机理，一旦病人疾病治愈，该类异常情况即消失。49改变的抗原；T、Tn活化及Cad多凝集；低频抗原抗体的反应；减弱或缺乏的抗体反应；年龄（老年

20、或婴幼儿）；丙种球蛋白过低血症丙种球蛋白缺乏血症；嵌合现象；未知的抗体反应；缗钱状形成；冷型自身抗体；未知同种抗体等。对非技术性错误，一定要查明原因，再作判断。50（2）抗体筛选与鉴定 要确定筛选与鉴定红细胞的抗原性。抗体筛选细胞要2-3 份单人份O红细胞，通常是 R1R1&R2R2 细胞，红细胞应明确表达常见的抗原:D,C,c,E,e,K,k,Fya,Fyb,Jka,Jkb,S,s,M,N,Mia,P1,Lea,Leb,Dia，而且尽可能是纯合子。抗体鉴定细胞要多于8份O红细胞，对常规抗体和混合抗体必须有明确的反应格局。51（3）交叉配血注意血液标本的身份；试管的正确标记；反应温度、时间、离心力、凝集结果的判断等。反应温度：IgM 4C IgG 37C 抗A、抗B在37C条件下反应活性是4C的1/31/3 要同时应用生理盐水介质和可检测IgG抗体的介质（抗球蛋白试剂试验、蛋白酶试验或凝集胺试验）进行交叉配血。52 IgM抗体在盐水介质中产生凝集5354 IgG抗体在盐水介质中一般不产生凝集55 酶处理、凝聚胺56 57 抗球蛋白试验 抗球蛋白58l 谢 谢 !