4783.炮制对五味子中的5HMF含量的影响研究论文正文

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1、毕 业 论 文（设计）题 目 炮制对五味子中的5-HMF含量的影响研究指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010 年 5月30日摘 要本文利用HPLC分析法的建立和验证实验，制定出科学可行的实验分析方法，并通过研究不同的炮制时间、温度和辅料用量对五味子中5-羟甲基糠醛（5-HMF）的含量影响来探讨五味子中5-HMF的主要影响因素，以控制五味子中5-HMF含量在高疗效低副作用的范围内。实验表明随炮制时间的延长及炮制温度的升高，五味子中5-HMF含量明显增加；随炮制辅料用量的增加，5-HMF含量变化呈两种趋势：蜜制五味子随炮制辅料用量增加5-HMF含量逐渐升高，酒制和醋制

2、五味子随炮制辅料用量的增加而含量逐渐降低，到40g/100g五味子的用量时，辅料量的增加对5-HMF产生量的影响变小。5-HMF对各炮制因素具一定敏感性，可考虑作为炮制程度的一个评价指标引入到五味子质量控制体系中来。关键词: 五味子；炮制；5-HMF；评价指标目 录引言.1第一章 分析方法的建立.21材料与仪器.22实验方法.23结果与讨论.43.1系统适应性.43.2线性关系.43.3精密度.53.4稳定性.53.5重现性.63.6加样回收率.64结论.7第二章 不同炮制方法对五味子中5-HMF含量的影响.71材料与仪器.72实验操作.83结果与讨论.93.1炮制时间对五味子中5-HMF含量

3、的影响.93.2炮制温度对五味子中5-HMF含量的影响.103.3炮制辅料用量对五味子中5-HMF含量的影响.114总结和建议.124.1实验总结.124.2建议.13参考文献.14引言炮制，又称炮炙，是指中药材按照其不同的药性和医疗要求所进行的多种加工方法的总称，也就是药物在应用前或制成各种剂型之前的加工过程1-4。五味子为木兰科多年生落叶藤本植物，五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.或华中五味子Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果实5-6，前者中国药典2000年版收载为五味子（俗称北五味子），后者收载为

4、南五味子。五味子最早列于神农本草经上品，中药功效在于滋补强壮之力，药用价值极高。关于五味子现代的主要文献记载的炮制方法7-8有：净制、醋制、酒制和蜜制。现今中国药典对五味子收载的炮制方法仅醋蒸一种,而药店出售的五味子饮片多为五味子的蒸制品或醋蒸品。5-HMF(5-羟甲基糠醛)，是葡萄糖或果糖等单糖化合物在高温或酸性环境催化等条件下脱水产生的一种醛类化合物，有毒。对眼、粘膜、皮肤有刺激性，能与人体蛋白质结合产生蓄积中毒，造成动物横纹肌麻痹和内脏损害，并且具有神经毒性，且有报道称其存在潜在的遗传及生殖毒性8。现代关于五味子炮制原理9-10的研究较少，如王琦7关于五味子的炮制作用描述：“五味子生品长

5、于敛肺止咳，生津止渴。醋五味子酸敛作用增强，多用于肝肾亏损的滑精、久泻等纯虚证。酒五味子多用于遗精。五味子经炒制后，有祛痰作用的酸性成分及有镇咳作用的挥发油均受到一定程度的破坏或损失，酒制、醋制后挥发油也略有减少，而各炮制品中具有强壮作用的木脂素类成分的含量则均似比生品偏高。醋五味子炮制后有机酸煎出量升高”。为验证不同的炮制方法11对五味子中5-HMF含量的影响，我们拟测定酒制、醋制、蜜制和蒸制四种炮制方法下不同时间、温度、辅料用量对5-HMF产生量的影响，得出一定的规律,可以将五味子的炮制工艺控制在疗效高、低副作用的水平上，提高我国中药质量，丰富中药理论知识，为生产实践提供技术支持，对将来其

6、它中药成分含量的控制起一定的启发作用。第一章 分析方法的建立1材料与仪器1.1材料与试剂乙腈（色谱纯，德国Merck公司）超纯水（milli-Q）5-HMF（购自美国Sigma公司）微孔滤膜（水膜，0.45m,天津琛航科技有限公司）不锈钢滤头（大连伊利特有限公司）五味子（Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.果实的炮制品，购自北京同仁堂。）1.2 实验仪器电子分析天平（梅特勒. 托利多仪器上海有限公司）Agilent1100高效液相色谱仪（含G1354A四元梯度洗脱泵；G1322A在线脱气装置；G1313A自动进样器，UV-Vis检测器，G1316A柱温箱），Ag

7、inlent1100色谱工作站Diamonsil C18柱（2504.6mm，5m；Dikma）加热套（TC-15套式恒温器，浙江新医疗器械厂）架盘药物天平（马头牌BP-II型，上海医用激光仪器厂）2 实验方法2.1 供试液的制备12.5g北五味子加入250ml去离子水后，浸泡2h后称重，进行煎煮保持微沸1小时，冷却后称重加水至原重，过滤，滤液用0.45m的微孔滤膜水膜过滤后作为供试液待测。2.2色谱分析条件及系统适应性考察色谱柱：Diamonsil C18柱（2504.6mm，5m；Dikma），流动相：水乙腈(95:5=V/V)，流速：1.0mLmin-1，检测波长：280 nm，进样量：

8、1l，检测时间：20 min。观察供试液中色谱峰的对称性、分离度和理论塔板数是否符合药典规定。2.3工作曲线的建立5-HMF储备液制备：13.62mg 5-HMF加入50ml容量瓶中，用纯水定容至刻度，作为储备液于4条件下保存。分别将储备液稀释为2.724,5.448,8.172,10.896, 13.62,16.344,27.24mg100ml-1的标准溶液。将标准溶液用0.45m的微孔滤膜水膜过滤后按上述分析条件进行HPLC分析。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，得浓度与峰面积工作曲线。2.4精密度考察将配制的标准溶液和样品溶液都根据上述分析方法分别重复进样六次，计算六次所得峰面积的相对

9、标准偏差。2.5稳定性考察将标准溶液和供试品溶液分别隔2h，4h，6h，8h，10h，12h，24h进样，根据上述分析方法进行分析，计算各自在24小时内峰面积的相对标准偏差。2.6重现性考察12.5g生五味子加250ml去离子水，浸泡2h，称重，保持微沸1h后称重，加水至原重，微孔滤膜过滤后做HPLC分析。在相同条件下制备6个样品溶液，计算6个供试液5-HMF峰面积的相对标准偏差验证供试液的批次差异是否在可信范围。2.7加样回收率考察在已知浓度的样品中加入一定量的5-HMF，根据上述方法测定5-HMF的含量，根据测定结果，计算出回收率。3结果与讨论3.1系统适应性流动相为配比为(95:5, V

10、/V)的水-乙腈时可达到较好的分离效果，分离度1.5，理论塔板数为4000，峰对称性为0.96，均可达到我国药典对药物分析的要求。该分析方法能够避开供试液中其它物质对5-HMF的检测干扰。有代表性的色谱图见图3.1。 (a) 5-HMF标准溶液谱图 (b)炮制五味子煎煮液图谱图3.1标准溶液和供试液的色谱图3.2线性关系以5-HMF 的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标作图，得出5-HMF峰面积与浓度线性关系见图3.2。5-HMF标准溶液的线性方程Y = 7376.8X + 6.8016，R2 = 0.9999，结果表明 5-HMF含量在0.02724 到 0.2724 mgml-1范围内与峰面积

11、有良好的线性关系。图3.2 5-HMF的标准曲线3.3精密度6个标准溶液和样品溶液的RSD（相对标准偏差）分别为0.14%和0.71%，分析仪器的分析误差在可信范围内。具体数据见表3.1和表3.2。表3.1 标准溶液的精密度数据 表3.2 样品溶液的精密度数据峰面积平均值RSD390.1390.3390.1390.4390.6391.6390.50.14%峰面积平均值RSD550.6553.2542.4544.9547.2547.8547.70.71%3.4稳定性结果显示5-HMF标液和供试液在24小时内有较好稳定性。标液和供试液24小时内测定值RSD分别为0.15%和1.23%。标准溶液和样

12、品溶液稳定性数据见表3.3和表3.4。表3.3 标准溶液的稳定性数据 表3.4 样品溶液的稳定性数据时间（h）峰面积平均值RSD2706705.80.15%4705.86703.88706.510706.912705.924705.8时间（h）峰面积平均值RSD2591.4596.41.23%4589.16604.28603.910600.712596.424588.83.5重现性在相同条件下制备的6个五味子样品中5-HMF含量差别不大，6个数据的RSD值为1.58%，样品的重现性数据见表3.5。表3.5 样品的重现性数据样品峰面积平均值RSD样品1578.8595.31.58%样品2595.

13、7样品3601.9样品4591.4样品5605.3样品6598.43.6加样回收率煎煮液中5-HMF的平均加样回收率为98.89%，相对标准偏差2.78%，平均加样回收率在95%-105%之间，符合药典常用的分析标准。5-HMF加样回收率数据如表3.6。表3.6 5-HMF加样回收率数据样品检测到量(mg)加入量(mg)加样回收率(%)平均值(%)RSD113.4613.6298.8398.892.78%213.0413.6295.77313.6413.62100.12413.3013.6297.66513.2513.6297.31614.1213.62103.654结论采用如下的分析条件：色

14、谱柱为Diamonsil C18柱（2504.6mm，5m；Dikma），流动相为水-乙腈(95:5=V/V)，流速为1.0mLmin-1，柱温为25，检测波长为280 nm，进样量为1l-10l，检测时间为20min，可以直接分析五味子煎煮液中5-HMF含量，达到较好分离效果。5-HMF分离度1.5，理论塔板数为4000，峰对称性为0.96，均符合我国药典对药物分析的要求。样品中5-HMF精密度的RSD为0.71%，稳定性RSD为1.23%，重现性RSD为1.58%，平均加样回收率为98.89%，能够避开供试液中其它物质对5-HMF的检测干扰，达到分析要求。采取直接进样法可以有效地避免在样品

15、前处理过程中人为造成的误差，而且可以排除煎煮液中其它杂质对检测的干扰。本分析方法样品处理简单，重现性好，所用分析时间短，可以应用于后面各实验中5-HMF的定量和定性分析。第二章 不同炮制方法对五味子中5-HMF含量的影响1材料和仪器1.1材料和试剂生五味子：为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的干燥、成熟果实，购自同仁堂，经浙江中医学院中药系陈孔荣教授鉴定，符合2005年版中华人民共和国药典。黄酒：金谷黄酒，杭州金谷酒业有限公司，400g/袋，糖度15.0g/L，酒精度14.0%（V/V）米醋：双鱼米醋， 杭州食品酿造有限公司，总酸3.5g/1

16、00ml蜂蜜：枣花蜜纯净水：杭州娃哈哈集团1.2实验仪器电子分析天平（梅特勒. 托利多仪器上海有限公司）水浴锅（余姚新波仪表公司）加热套（TC-15套式恒温器，浙江新医疗器械厂）微孔滤膜（水膜，0.45m,天津琛航科技有限公司）2 实验操作（1）炮制炮制时间的影响取100g生五味子置于密封保鲜盒中，加入黄酒（米醋、蜂蜜30g、纯净水） 20g，待辅料被五味子吸干后，置于水浴锅中，分别煮沸（100）炮制2h、4h、6h、8h。炮制温度的影响取100g生五味子置于密封保鲜盒中，加入黄酒（米醋、蜂蜜30g、纯净水） 20g，待辅料被五味子吸干后，置于水浴锅中，分别于75、80、85、90、95、10

17、0下炮制4h。辅料用量的影响 取100g生五味子置于密封保鲜盒中，加入黄酒（米醋、蜂蜜）10g、20g、40g、60g、80g、100g，待辅料被五味子吸干后，置于水浴锅中，煮沸（100）炮制4h。（2）制样分析取12.5g五味子样品于圆底烧瓶中，加入250ml去离子水，浸泡2h，称重，保持微沸煎煮1h，冷却后称重补重，过滤，再用微孔滤膜过滤，作HPLC分析。3结果与讨论3.1炮制时间对五味子中5-HMF含量的影响炮制时间对五味子中5-HMF的影响的结果见表3.1和图3.1。从图表中可以看出五味子中5-HMF的浓度随炮制时间的加长而增加，蜜制后的浓度远远高于蒸制、醋制和酒制，而蒸制、醋制和酒制

18、三种制法的差别并不是很大。表3.1 炮制时间对五味子中5-HMF的影响炮制时间（h）5-HMF浓度（mg/100ml）蜜制酒制醋制蒸制246816.2733.4237.7440.174.266.056.48.833.315.376.647.125.888.739.6710.65图3.1 炮制时间对五味子中5-HMF的影响3.2炮制温度对五味子中5-HMF含量的影响炮制温度对五味子中5-HMF的影响的结果见表3.2和图3.2。从图表中可以看出：五味子中5-HMF的浓度随着炮制温度的升高，蜜制后的浓度明高于其他三种制法，且其升高幅度大于其他制法；蒸制、醋制和酒制的差别并不是很大；80时四种制法没有

19、什么差别，80以前变化也不明显，这正应证了五味子高温条件对5-HMF生成的催化作用。表3.2 炮制温度对五味子中5-HMF的影响炮制温度（）5-HMF浓度（mg/100ml）蜜制酒制醋制蒸制75800.883.411.451.591.241.41.651.85857.442.772.171.99019.392.632.633.479522.12.813.115.2910037.746.055.378.73图3.2 炮制温度对五味子中5-HMF的影响3.3炮制辅料用量对五味子中5-HMF含量的影响炮制辅料用量对五味子中5-HMF的影响见表3.3和图3.3。从图表中可以看到，蜜制后五味子中5-HM

20、F浓度随蜂蜜加入量的增加而增加，而其他两种制法却正好相反，而且蜜制后的含量远远高于酒制、醋制；酒制和醋制的差别并不是很大。表3.3 炮制辅料用量对五味子中5-HMF的影响辅料用量（g）5-HMF浓度（mg/100ml）蜜制酒制醋制1013.077.126.142023.986.055.374038.554.644.516038.934.264.158040.863.843.9610041.173.323.82图3.3 炮制辅料用量对五味子中5-HMF的影响我们可以从以上结果发现四种炮制因素中，炮制辅料用量对五味子中5-HMF的浓度影响明显大于其他三种，且其中蜜制后的五味子中5-HMF的含量远远

21、高于蒸制、酒制和醋制后的五味子，所以炮制辅料用量是五味子炮制过程中5-HMF的主要影响因素。4总结和建议4.1实验总结在研究中发现，随炮制时间的延长及炮制温度的升高，五味子中的5-HMF含量逐渐增加。随着炮制辅料用量的加大，5-HMF含量变化呈两种趋势：蜜制五味子随炮制辅料用量加大而含量逐渐升高，酒制和醋制五味子随炮制辅料用量的加大而含量逐渐降低，但到40g/100g五味子以上的用量时，辅料量的增加对5-HMF产生量的影响变小。和对炮制黑润程度这个感观指标的影响相比，五味子中5-HMF含量对炮制时间、炮制温度及炮制辅料用量均有一定敏感性，可以考虑作为一个五味子炮制程度的质量指标对五味子的炮制程

22、度控制进行指导。4.2建议HPLC法测定5-HMF的量时，五味子样品液可以不用经过浓缩、重新溶于水等复杂的过程，而直接进行进样分析，这样简化样品处理过程可以更加真实地反应实验的真实情况。样品的处理周期不能太长，避免外界条件变化引起的实验数据的不准确。可以结合炮制对五味子中木脂素等药效成分的含量，选择药效好副作用少的炮制条件。可以将5-HMF的含量作为一个量化指标、来衡量五味子炮制的程度。参考文献1 叶定江, 张世臣主编. 中药炮制学M. 北京: 人民卫生出版社. 1999, 3. 528-530.2 孙家艳1, 陈毓. 中药炮制对化学成分及疗效的影响, 中华实用中西医杂志J. 2005, 18

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