三聚氰胺报告

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1、三聚氰胺及其检测方法三聚氰胺是一种重要的有机化工原料，其最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂 （ST）的原料。本来三聚氰胺与食品或者饲料行业毫不相干，但不法商人在食品或饲料中添 加三聚氰胺（ 即所谓的“ 蛋白精”），主要是利用三聚氰胺的高含氮量（66.7）来提高 产品的表观蛋白质含量。三聚氰胺事件变成社会热点话题是在07年3月份，美国因宠物饲料致死猫狗事件大量召 回被三聚氰胺污染的宠物饲料。之后“ 蛋白精”愈演愈烈， 2008 年爆发了婴幼儿因食用了 含三聚氰胺的奶粉而致肾结石甚至死亡的恶性事件。卫生部等五部门立即颁布了“2008 年 第25 号乳制品及含乳食品中三聚氰胺临时管理限量值规定”

2、的公告，规定：婴幼儿配方乳 粉中三聚氰胺的限量值为1 mg/Kg，液态奶（包括原料乳）、奶粉及其他配方乳粉中三聚氰 胺的限量值为2.5mg/Kg。因此建立快速的检测方法以确保食品的安全十分必要。、三聚氰胺1.1三聚氰胺的概念三聚氰胺（英文名Melamine），是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有 机化工原料。简称三胺，又叫2 ,4 ,6- 三氨基-1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6- 三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，分子式CNH、CN（NH），分子量126.12。其3 6 6 3 3 （ 2）3结构式为：1.2三聚氰胺的性质（一）物理性质三聚氰胺

3、性状为纯白色单斜棱晶体，无味，密度1.573克/厘米3 （16C）。常压熔点354C （分解）；快速加热升华，升华温度300C。溶于热水，微溶于冷水，极微溶于热乙醇，不 溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。（二）化学性质呈弱碱性（PKb=8），与盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、草酸等都能形成三聚氰胺盐。在中 b性或微碱性情况下，与甲醛缩合而成各种羟甲基三聚氰胺，但在微酸性中（PH值5.5-6.5） 与羟甲基的衍生物进行缩聚反应而生成树脂产物。遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟 基取代，先生成三聚氰酸二酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸。（三）生物学

4、性质三聚氰胺由德国化学家Justus von Liebig于1834年首次合成，是一种三嗪类含氮杂环 有机化合物，重要的氮杂环有机化工原料。经肠道吸收后哺乳动物肝脏不能转化代谢三聚氰 胺，最终三聚氰胺及其转化物三聚氰酸被血液运送到肾脏，随尿液排出体外。在此过程中， 由于尿液浓缩作用，可能相互聚集或与钙形成结石，造成肾小管物理阻塞，继而形成肾结石， 导致肾脏积水，严重时导致肾功能衰竭。（四）毒理学特性三聚氰胺对哺乳动物低毒。大鼠连续2h吸入粉尘200mg/kg，未见中毒症状。大鼠 80mg/kg100mg/kg，2 次/ 天，6 次/ 周，连续4 个月以上，现体重增加迟滞，中枢神经系 统及肾功能

5、紊乱，肺内炎性改变等，长时间反复接触可对肾脏造成损伤。 OkumuraM 等给 F344 雄性大鼠饲喂不同浓度三聚氰胺饲料36周，结果证明饲喂含3聚氰胺饲料能导致 F344鼠的膀胱结石形成，并且诱发膀胱肿瘤和输尿管肿瘤。随着膀胱结石发生率的增加， 公鼠膀胱肿瘤发病率也呈现增加趋势，而且这两个发病率之间高度相关。在2007 年的宠物 食品中毒事件中，受害宠物被诊断发生了组织病理学、毒理学和临床病理学的变化。对这些 动物进行的临床症状分析和实验室诊断均可确诊为尿毒症，具体症状包括食欲减退、呕吐、 昏睡、多尿症、氮血症以及高磷（酸盐） 血症。现有针对三聚氰胺的毒理试验也还只是停 留在动物实验上，没有

6、针对人类的。1.3三聚氰胺的主要用途（1）装饰面板：可制成防火、抗震、耐热的层压板，色泽鲜艳、坚固耐热的装饰板，作飞 机、船舶和家具的贴面板及防火、抗震、耐热的房屋装饰材料。（2）涂料：用丁醇、甲醇醚化后，作为高级热固性涂料、固体粉末涂料的胶联剂、可制作 金属涂料和车辆、电器用高档氨基树脂装饰漆。（3）模塑粉：经混炼、造粒等工序可制成蜜胺塑料，无毒、抗污，潮湿时仍能保持良好的 电气性能，可制成洁白、耐摔打的日用器皿、卫生洁具和仿瓷餐具，电器设备等高级绝缘材 料。（4）纸张：用乙醚醚化后可用作纸张处理剂，生产抗皱、抗缩、不腐烂的钞票和军用地图 等高级纸。（5）三聚氰胺甲醛树酯与其他原料混配，还可

7、以生产出织物整理剂、皮革鞣润剂、上光剂 和抗水剂、橡胶粘合剂、助燃剂、高效水泥减水剂、钢材淡化剂等。（6）少量时可用于我们日常食用的点心中，如：桃酥。（7）农业：在农业中三聚氰胺是用来加在化肥中的。二、三聚氰胺的检测方法经大量文献的查阅，我总结了十三种用于检测三聚氰胺的方法，这些方法不仅仅局限于 原料乳及乳制品中的三聚氰胺，还包括宠物饲料等中三聚氰胺残留测定。分别是气相色谱- 质谱联用检测方法、高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-串联质谱法、超高效液相色 谱与质谱联用法、离子交换色谱-紫外检测法、酶标仪检测法、表面增强拉曼光谱法、电位 滴定法、重量法、苦味酸法、升华法、高效毛细管电泳法。在气

8、相色谱法中，常用气相色谱 -质谱联用法测定。2008年10月7日，国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准发布了原 料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法（GB/T 22388-2008 ）国家标准，标准自发布之日起实 施。标准规定了高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）、气相色 谱-质谱联用法（GC-MS和GC-MS/MS）三种三聚氰胺的检测方法，检测定量限分别为2毫克 /千克、 0.05毫克/千克和0.01毫克/千克。各种方法各具优点和不足，应根据检测对象及其限 量的规定，选用与其相适应的检测方法。在以下三种方法中，前两种分别选取了具代表性的 不同样品即原

9、料乳及乳制品和宠物饲料中三聚氰胺进行了检测。 （一）气相色谱-质谱联用检测方法（ GC-MS）（GB/T 22388-2008国家标准规定方法） 1.1实验原理试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，将提取液离心后经混合型阳离子交换固相萃取 柱净化，用N, O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化，然后采用选择离子监测质 谱扫描模式(SIM)或多反应监测质谱扫描模式(MRM)，用化合物的保留时间和质谱碎片的 丰度比进行定性分析，外标法定量GC- MS法的最低定量限为0.05mg/kg。GC- MS法需要衍生 化处理，过程比较繁琐，但是灵敏度高，方法稳定。目前国内多数分析实验室采用该方法分 析

10、婴幼儿奶粉中的三聚氰胺。1.2试剂与材料吡啶(色谱纯)；衍生化试剂(色谱纯)；乙酸铅溶液(22 g/ L)；氩气；甲醸色谱纯；乙腈:色谱 纯；氨水；三氯乙酸；柠檬酸；辛烷磺酸钠色谱纯；三聚氰胺标准品(CAS108278201):纯度 大于99. 0 %；微孔膜；海砂；甲醇水溶液；三氯乙酸溶液(1 %)；氨化甲醇溶液(5 %)；离子 对试剂缓冲溶液；三聚氰胺标准储备溶液；阳离子交换固相萃取柱。1.3仪器设备气相色谱-质谱联用仪(气相色谱-质谱/ 质谱仪) :配有电子轰击电离离子源( EI) 。分析天平: 感量为0. 0001 g 和0. 01 g ;离心机:转速不低于4000 r/ min ;超

11、声波水浴;固相萃取装置;氮气 吹干仪;涡旋混合器;具塞玻璃离心管;研钵。1.4实验步骤1) 提取(液态奶、奶粉、酸奶、奶糖等)(1)称取5 g (精确至0. 01 g)试样于50 mL,具塞玻璃离心管; 加入25 mL三氯乙酸溶液； (3)涡旋30 s ; (4) 加入三氯乙酸15 mL ; (5) 超声提取15 min ; (6) 加入2 mL 乙酸铅; (7) 三氯 乙酸定容至50 mL ; (8) 10000 r/ min 离心10 min ，上清液待净化。2) 净化(1) 将待净化的溶液准确转移5 mL 至固相萃取柱中; (2) 3 mL 水淋洗; (3) 3 mL 甲醇淋洗; 抽至近

12、干;3 mL氨化甲醇洗脱，收集淋洗液;(6)淋洗液于50 C下氮气吹干待衍生化。3 )衍生化在上述氮气吹干的残留物中加入600 p L吡啶和200|J L衍生化试剂，混匀,70 C反应30 min，氮气吹干，准确加入800p L吡啶,供气相色谱2质谱及气相色谱2质谱/质谱定性定量分 析。4) 仪器参考条件(1)色谱柱:5 %苯基二甲基聚硅氧烷石英毛细管柱,30 m X0. 25p m X0. 25 mm或者相当；(2) 载气流速:1. 0 mL/ min ;(3) 传输线温度:250 C;(4) 进样口温度:250 C;进样量：1p L ;(6) 进样方式:无分流;(7) 程序升温:70 C保

13、持1 min，以10 C/ min的速率升温至200 C,保持10 min ;(8) 离子源温度230 C;(9) 扫描模式：选择离子扫描：定性离子m/ z99、171、327、342，定量离子m/ z 327。5) 工作曲线的绘制将三聚氰胺标准溶液逐级稀释，配制成衍生物浓度为:0. 05 、 0. 1 、 0. 2 、 0. 5 、 1 、 2 p g/ mL 的标准溶液，气相色谱-质谱仪分析，以浓度与定量离子的峰面积作图，绘制标准工作曲线。6) 定量测定 待测溶液中三聚氰胺的响应值应在工作曲线的线性范围内，超过线性范围则应对净化液稀释， 重新衍生化后再分析。7) 定性确证以标准样品的保留时

14、间和监测离子( m/ z 99 、 171 、 327 、 342) 定性，待测样品中4 个离子 的丰度比相差不大于20 %。8) 结果计算A x c x VxlOOO1= % f (1As x mxlOOO式中：才 试样中三聚氤胺的含暈，单位为毫克每干克(mglg);A样液中三聚就胺的峰而积；r 标准溶液中三聚飢胺的浓度单位为微克每毫升(ligmL)；V样液垠终定容体积，单位为毫升inLh标准溶液中三聚貳胺的峰面积；加试样的质量，单位为克名)；/稀释倍数9) 空白实验 除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。(二)高效液相色谱法(HPLC) (GB/T 22388-2008国家标准规定方

15、法)高效液相色谱法相比气质联用法简便、快速,适用于食品中含量较高的三聚氰胺的定量 分析，且有许多研究致力于用高效液相色谱法测定宠物饲料中的三聚氰胺，因此在介绍高效 液相色谱法时以宠物饲料为原料。2.1实验原理HPLC的原理是，试样中的三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，将提取液离心后经混合型阳 离子交换固相萃取柱净化。洗脱物吹干后用甲醇溶液溶解，用高效液相色谱仪进行测定。 HPLC的最低定量限为2mg/kg0测定时间约为10min,操作简便，结果准确，但不能满足国家 关于婴幼儿奶粉中三聚氰胺的限量要求。辜雪英等建立了饲料中三聚氰胺残留量的高效液相色谱分析方法，样品经反相柱分离后 采用波长为245 nm

16、的紫外检测器进行检测，该方法具有准确、快速、高效的特点。张美金等 建立了高效液相色谱法测定饲料和宠物食品中三聚氰胺的含量0饲料和宠物食品中三聚氰胺 的定量检测限是1. 0 mg/ kg,添加水平为1. 0 mg/ kg时，样品加标回收率为81 %105 %,RSD 85 为20 V， m/z 12768 为35 V。4）标准曲线的绘制取空白样品按照4.4 处理。用所得的样品溶液将三聚氰胺标准储备液（3.2.12）逐级稀释得 到的浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 p g/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以 定量子离子峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。5）定量测定

17、待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分 析。6）定性判定按照上述条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中的质量色谱峰保留时间与标准工作溶液 一致（变化范围在2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当 标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在三聚氰胺。表1定性离广相对丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%至 50%10% 至 20%10%允许的相对偏差=20%25%30%=50%7）结果计算同气相色谱-质谱联用检测方法（四）超高效液相色谱与质谱联用张静等建立了利用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四级杆

18、质谱技术测定宠物食品中三 聚氰胺的方法。利用三氯乙酸溶液提取蛋白中的三聚氰胺,并形成蛋白络合物沉淀,乙酸铅溶 液结合含有SO42 -、SO32 -等离子的杂质形成沉淀，进一步提高提取效率,同时三氯乙酸可作为 离子对试剂,进行液相色谱-质谱分析。钱振杰等采用超高效液相色谱进行分离,建立了饲料中 三聚氰胺的超高效液相色谱-电喷雾串联质谱测定方法。饲料样品经1 %三氯乙酸-二甲基亚 砜提取,Water s Oasis MCX柱净化，超高效液相色谱分离,最终采用电喷雾串联四极杆质谱进 行检测。（五）离子交换色谱-紫外检测法 何强等建立了离子交换色谱-紫外检测法测定乳制品中的三聚氰胺。样品直接用水和乙腈

19、提取，分析时用LC-SCX离子交换色谱柱分离，在紫外波长240 nm下检测。三聚氰胺在0.5 100.0 mg/ L 的范围内,质量浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系（ R = 0.999 9） ,最低检出限 为1.0 mg/ kg ,加标回收率在93.8 %102.5 %范围内。该方法简便、快速、准确,能够满足检 测要求。（六）酶标仪检测酶联免疫吸附分析法（EL ISA ）是目前免疫学领域中应用最为广泛的免疫化学测定方法, 酶联免疫（ELISA ）的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫 活性。使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫 活性

20、，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体 按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原 抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的 比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量 直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极 大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的灵敏度,并在诊断、疾病监控以及研究用 途方面得到了广泛的运用。酶联免疫吸附测定法定量测定三聚氰胺残留，利用萃取液通过均质及振荡的方式提取样 品中的三

21、聚氰胺进行免疫测定。先将三聚氰胺酶标记物,样品萃取物及标准样加入到已经包 被有三聚氰胺抗体的微孔中开始反应。 在30 min 的孵育过程中,样品萃取物中的三聚氰胺 与三聚氰胺酶标记物竞争结合微孔中的三聚氰胺抗体,孵育30 min 后洗掉小孔中所有没有 结合的三聚氰胺及三聚氰胺酶标记物。在配制的洗液清洗结束后,每孔中加入清澈的底物溶 液,结合的酶标记物将无色的底物转化为蓝色的物质。 孵育30 min 后加入终止液（盐酸） ,终 止底物反应,在450 nm 波长处检测吸光度值,根据各孔颜色深浅进行数据读取,依据标准的吸 光度值得出样品中三聚氰胺的的浓度值。（七）表面增强拉曼光谱法（SERS）何莉莉

22、等利用表面增强拉曼光谱法和金纳米培养基（ PLS） 相结合的方法测定三聚氰 胺、氰尿酸和三聚氰胺尿酸盐残留量。通过测定样品的拉曼振动光谱特征,确定三聚氰胺的 含量。三聚氰胺拉曼光谱峰在676 cm- 1处。该方法最低检出限（LOD）为2. 6 X 10 - 7 mol/ L , 但与PLS分析技术结合后可使SERS信号强度增强3X104倍，这一结果是基于在676 cm- 1处溶 液中三聚氰胺的拉曼光谱和SERS相比较而得，且氰尿酸的固体形态和溶液中的SERS光谱是 显著不同的,表明了溶液中氰尿酸酮烯醇结构是存在的。研究结果表明SERS能够快速、准 确地测定溶液中三聚氰胺及其衍生物的含量。（八）

23、电位滴定法袁立勇等利用电位滴定法测定溶液中三聚氰胺的含量,相对标准偏差不大于0.50 %。 其 方法为:称取约1.5 g （精确至毫克） 样品于200 mL 烧杯中,加入100 mL 蒸馏水,加热,使试样 完全溶解。用硫酸标准溶液滴定热溶液至p H值为5。流水冷却溶液至室温，滴定，每次准确 加入0. 1 mL硫酸标液,并记下相应的p H值（精确至0.01 p H单位），直至p H值约为3。由记 录的数值计算一阶微商和二阶微商，找出二阶微商为零时的滴定等量点，计算出等当量点时消 耗硫酸标液的体积，就可以计算出溶液中三聚氰胺的含量。（九）重量法伍云虎通过溶剂溶解去除三聚氰胺氰尿酸盐（MC）产品中的

24、三聚氰胺与氰尿酸，用重量 法测定产品中的三聚氰胺氰尿酸盐的含量。此法操作简单，精密度和准确度都较高，是较为理 想的测定MC产品中三聚氰胺氰尿酸盐含量的方法。（十）苦昧酸法 苦味酸法如下：将水加入试样，加热溶解后，加人苦味酸溶液，称量所生成的苦味酸三 聚氰胺沉淀的质量，即测得三聚氰胺纯度含量。分析步骤：称取试样，置于烧杯中，加水、 加热溶解；冷却后，加入酚酞指示液3滴，若显红色，加入硫酸溶液，直至溶液颜色消失， 若有不溶物，需过滤，水洗；把滤液和洗液合并，移人500 mL容量瓶中，加水至刻度，仔 细振摇混合后，准确吸取100 mL置于500 mL烧杯里；将此溶液加热至80C，再加入已加热 至80

25、C的100 mL苦味酸溶液，冷却至室温后，保持在15C以下约8 h；用已恒重的玻砂过滤 器过滤，之后，先用约100 mL苦味酸三聚氰胺的饱和溶液洗涤，再用水洗；烘干玻砂过滤 器，置于干燥器中冷却后，称量求得沉淀物质量。（十一）升华法 升华法测定法如下：在升华装置中将试样在负压下进行加热，让三聚氰胺完全升华后， 称其残渣量，升华前后的质量差值即为三聚氰胺的含量。分析步骤：称取试样，置于预先干 燥了的且已知质量的试样容器里；将试样容器置入减压升华装置内，待完全密闭后，开启真 空装置缓缓抽气，并调节装置内的温度，经2 h升华结束；取出试样容器，冷至室温后，称 量试样容器的质量。（十二）高效毛细管电泳

26、法高效毛细管电泳法-二极管阵列检测器（HPCE-DAD）检测方法可以检出牛奶和奶粉中 的三聚氰胺。使用长度58.5cm、内径75um的毛细管柱，分离电压25KV，进样量3.5KPa（35mbar） X8s，分离温度25C，缓冲溶液20mmol/L,柠檬酸-40mmol/L,磷酸氢二钠（PH2.6），检测波 长232nm,分析物在1-100mg/L范围内线性良好,牛奶和奶粉的定量限分别为0.5mg/Kg和 1.0mg/Kg,在添加水平为定量限浓度至50mg/Kg时的回收率为72.7%-97.3%，相对标准偏差 为2.1-3.9食品检验与分析报告07食品科学与工程马俊花170112007028聚 氰 胺 及 其 检 测 方 法