酵母蔗糖酶的分离提取

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1、酵母蔗糖酶的分离提取摘要：介绍了从酵母菌中提取蔗糖酶的过程和方法。利用有机溶剂自溶法、质量分数50%乙醇分级和透析的方法 纯化蔗糖酶，测得蔗糖酶的总活力和蛋白质含量均逐渐下降。关键词：酵母、蔗糖酶、提取、纯化Abstract:This paper introduces the process and the method of invertase extraction from yeast.Then the purified invertase was obtained by adding organic dissolvant,precipitatation with 50% ethyl al

2、cohol and dialyzing。The results showed the whole vigour and the content of potein was all decreased by degrees.Key words: yeast;invertase;extraction;purification蔗糖酶（invertase）（ 6-D-呋喃果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26），又称转化酶，特异地催化非还原糖中的 6-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对 专一性。不仅能催化蔗糖水解生成 D-葡萄糖和D-果糖

3、，也能催化棉子糖水解，生成密二糖 和果糖。由于果糖甜度高，约为蔗糖的1.36-1.60倍，在工业上具有较高的经济效益，蔗糖 酶的最适温度为45C50C，最适ph为4.04.5.1.材料与方法1.1试剂1）酵母粉（实验室提供）2）醋酸钠（0.5g）3）乙酸乙酯（8ml）4）10%醋酸5）无水乙醇6）蒸馏水7）3,5-二硝酸水杨酸试剂（DNS）8）考马斯亮蓝G-5209）5%蔗糖10）NaOH 溶液11）系列标准蛋白液12）9%生理盐水13）蛋白质染色液14）磷酸缓冲液 buffer （0.005mol/L PH6.0）注：整个实验应避免高温，以防止酶失活（水浴温35 C）1.2器材1）量筒25m

4、l2）烧杯 100ml、500ml3）大小试管若干4）吸耳球、玻棒、胶头滴管、PH试纸、各种滴定管5）恒温水浴锅、冰水浴锅6）秒表7）离心管、离心机8）分光光度计9）冰箱10）透析袋11）托盘天平1.3操作方法1.3.1蔗糖酶粗品制备方法1）自溶法 将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次地加入15mL蒸馏水，搅拌均 匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8mL乙酸乙酯，搅匀，盖好，于35C恒温水浴中搅拌30min。2）抽提补加蒸馏水10mL，搅匀，盖好，于35C恒温过夜，4000r/min离心10min, 弃沉淀，得E1;量体积V1=17.5mL,取出2mL置于4C冰箱保存，待测酶活力及蛋白质浓

5、度（留 样1）。3）乙醇分级和透析测E1 PH :用10%HAC调PH至4.5（注意少量、慢加、搅匀，防止调过）共加入0.5ml 10%HAc;第一次乙醇分级（30%乙醇饱和度）：计算出使E1得乙醇浓度达30%时所需的无水乙醇X 1的体积为6.6ml，将El和乙醇乂1，放入冰浴中预冷，在不断搅拌下缓慢滴加乙醇，4000 r/min离心10min，弃沉淀，留上清，得E2；量体积V2=19.5ml （留样2）;第二次乙醇分级（50%乙醇饱和度）同上法加入X2（为达50%乙醇饱和度时需要补加的 无水乙醇的体积），计算的加入无水乙醇X2为7.0mL。4000 r/ min离心10min，弃上清， 沉淀

6、立即用10ml / 150mol / LPH6.0的磷酸溶解，并装入透析袋，透析6小时，之后，4000 r / min 离心 10min，得 E3，量体积 V3 = 11.0mL （留样 3）;1.3.2测蔗糖酶活性方法取5%的蔗糖、酶液5ml分别于35C水浴中预热5min若酶浓度过高，用0.02mol/1的醋 酸缓冲液（PH=4.7）适当稀释。从留样的2ml中取0.1ml稀释150-200倍，即得稀释后的酶液。表1蔗糖酶水解蔗糖试管015%蔗糖（mL）221 mol/ml NaOH (mL)0.5酶液（mL）223 5C水浴，3min1 mol/ml NaOH (mL)0 . 5表2还原糖的

7、测定试管012反应液（mL）0 . 50 . 50 . 5（取自表1中0管）（取自表1中1管）（取自表1中1管）DNS 试剂（mL）333水（mL）1 . 51 . 51 . 5沸水浴5min后，立即流水冷却水（mL）2 02 02 0OD520在葡萄糖标准曲线上找到所测定光吸收值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力：蔗糖酶活力单位=葡糖糖毫克数X9X酶的稀释倍数在本实验条件下，每3min释放1毫克还原糖所需的酶量，定义为一个活力单位。1.3.3葡萄糖浓度标准曲线在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色测定。采用DNS 比色法测定还原糖的含量，同时用DNS闭塞定糖法

8、测定蔗糖酶的活力。表3葡萄糖浓度标准曲线的制作项目空白 123456含糖总量mg00.81.21.62.02.42.8葡萄糖液ml00.40.60.81.01.21.4蒸馏水ml2.01.61.41.21.00.80.6DNS试剂ml3333333加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水ml20202020202020光密度OD520nm以葡萄糖（mg）含量为横坐标、A520值纵坐标，画出工作曲线。根据得到的葡萄糖曲线，得到公式为：y=0.0746x+0.00241.3.4蛋白质浓度测定考马斯亮蓝G250染色法1）蛋白质标准曲线的制作表4蛋白质定量测定标准曲线制作溶液管T管7管

9、5管 留样1 留样1系列标准蛋白液mL0.20.40.60.81.00.50.5实际蛋白质含量ug204060801000.9%生理盐水mL1.00.80.60.40.2蛋白质染色液mL5.05.05.05.05.05.05.05.0轻轻摇匀，5min后以0号管调空白，595nm分光光度法测光密度值，汇出标准曲线。未知样品从标准曲线上查出相应浓度经测定，得蛋白质含量与光密度值测定结果876543210值度密光系列1线性（系列1）表5蛋白质含量与光密度值测定结果试管号1管2管3管4管5管实际蛋白质含量mg0.020.040.060.080.1OD5950.1860.2860.4170.5010.

10、677蛋白质标准曲线图0.020.040.060.080.10.12蛋白质毫克数根据得到的蛋白质曲线得到公式：Y=0.0543+5.985X2）蛋白质浓度测定从留样中取0.3ml加0.9%的Nacl稀释至3ml,再按以下表格操作测定表6蛋白质浓度OD值溶液对照组留样1留样1系列标准蛋白液/ml0.50.50.9%生理盐水/ml1.00.50.5蛋白质染色液/ml5.05.05.02结果经测量和计算得：表7 蔗糖酶活力单位OD520样本稀释倍数12平均E11500.8610.9110.886E21000.5860.5380.562E31000.7610.7970.779表8 蛋白质浓度试管OD5

11、95E1E2E310.8420.5540.18120.9390.5260.190平均0.8910.5400.186蛋白质毫克数0.1400.08120.0220表9蔗糖酶分离提取效果计算结果留样体积蛋白质浓度总蛋白活力 总活力U比活力纯化倍产量mlmg/mlmgU/mlU/mg数（回收率）117.52.80049799.5413991.95285.551100219.51.62431.668337.556582.23207.850.72847.04%311.00.4424.862468.455152.951059.843.71236.83%3. 讨论与分析3.1由表9蔗糖酶分离提取效果计算结果

12、可知，因为随着酶分离提取步骤越来越多，其回收 率逐渐下降，则每次提取后得到酶的量逐渐减少，总蛋白的量及酶的总活力逐渐下降。但是，纯 化倍数逐渐升高，即酶在分离提取过程中，酶中含有的杂质越来越少，纯度越来越高，比活力也 随之升高。3.2在整个实验过程中，采用了自溶法、抽提、乙醇分级和透析的方法。3.2.1细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。 提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。材 料不同，破壁的方法也不同。我们用的酵母菌细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH 值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使

13、细胞内的物质释放出来。3.2.2 在离心抽提过程中，对称离心管必须使用托盘天平，以防止离心机震荡明显，造 成事故。同时，离心管底端不能破裂，以防止在离心过程中，高速旋转加快离心管的破裂程度。 测量过程中，应先测酶活力，再测蛋白质浓度。因为测酶活力时，可将酶液做适当的稀释，倘若 酶液浓度过高，可加大酶液的稀释倍数。方便后续过程中对蛋白质浓度的测定。3.2.3乙醇分级和透析对酶做了进一步的提纯，增加酶液的浓度和纯度。其中，因为蔗 糖酶的本质是蛋白质，所以透析原理是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他 小分子物质如无机盐、单糖等分开。透析是把待纯化的酶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液

14、 中进行。3.2.3蔗糖酶活力的测定过程中，试剂应该按照顺序加入，蔗糖酶水解蔗糖用的试剂中 有1 Mol/L的NaOH，该试剂起的作用是钝化蔗糖酶，倘若还原糖测定的OD520值很大，则因酶液的 浓度很大，造成了NaOH的钝化作用不明显，所以测酶活力时，适当加大酶的稀释倍数。除此之外， 应该熟练掌握722S分光光度计的使用方法，具体操作流程：按MODE打到“T”，调100%，拉杆， 调“0”，按MODE打到” A”，再拉杆测量。3.2.4 蛋白质定量测定中，对于各留样应该设置平行实验和空白实验，两次测得的值取 平均，减少实验的系统误差。4. 建议和改善4.1自溶法过程中，需加少量防腐剂，以防外界

15、细菌污染。自溶法的缺点是时间较长。可 采用其他方法进行。酶的分离纯化有许多种方法，离心、过滤、膜分离、演习沉淀、等电点沉淀、 选择性变性沉淀、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、凝胶电泳、有机溶剂萃取、浓缩、结晶 等，在酶的分离纯化过程中，应该充分考虑避免酶的变性失活。一般情况下，所有分离纯化操作 都应在低温条件下进行，而且要防止过酸、过碱、重金属离子、变性剂、剧烈搅拌等因素对酶活 性的影响。近年来，高效液相层析(HPLC)和电泳技术越来越发达。4.2测量时，应将剩余的酶液保存于适合温度下的冰箱中，以防止酶液的变性或失活。因 此，可增加对实验的设计，考察不同温度梯度下，酶液活力的变化，并寻找在其

16、他适合条件下， 酶活力最大时的最适温度，并寻找适合保存酶的温度。4.3由于透析时间过长，则可采用超过滤的方法进行，利用压力或离心力，强行使水和其 他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上以达到浓缩和脱盐的目的，减少时间。同时， 用HAC调PH至4.5时，利用的是蔗糖酶的最适PH为4.04.5。因此，可增加实验，即在其他适 合的条件下，通过不同PH梯度下的酶活力的大小，测出蔗糖酶的最适PH值，加强实验的说服力 和学生的实验操作能力。5. 参考文献1)阎伯旭、高培基.内切葡聚糖苷水解酶的分离纯化和内源荧光性质.生物化学杂志,1997,13(5):5805852)王建枝，何善述，等.绒毛#1,4

17、葡萄糖苷酶的研究.生物化学杂志,1990,6(2):1021063)袁静明，张崇华，等.戊二醛交联根霉葡萄糖淀粉酶的研究.生物化学与生物物理学报,1990,22(3):2892924)余瑞远，倪逸生，等.大鼠、小鼠胰蛋白酶的分离纯化及动力学性质.生物化学杂志,1993,9 (6):6596635) BAILEY M, PETER B, KAISA P. Interalbortory testing of methods for assay of xylanase activity. J Biotech,1992,23:2572706)朱静,严自正.微生物产生的木聚糖酶的功能和应用,生物工程学报,1996,12(4):3753787)苏拔贤.生物化学制备技术.北京:科学出版社,1986,1.30-36