质粒载体的构建

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1、质粒载体的构建摘 要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次 PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切 位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到 T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有 PCAMBIA1381的DH5 a感受态细胞中复制表达。关键词：质粒 DNA PCR 电泳 感受态 转化1.引言质粒(plasmid)是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的 遗传成分。其特点如下： 是染色质外的双链共价闭合环形DNA (cccDNA)，可自然形成超螺旋结构，

2、不同质 粒大小在2-300kb之间，15kb的小质粒比较容易分离纯化，15kb的大质粒则不易 提取。 能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而 传给后代。 质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的 特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合 成能分解破坏四环素、氯霉素、氨节表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药 性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。 所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体 都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改

3、造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载 体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者 Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。 优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行 使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三 个优点。质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后， 每个细胞中可累积1

4、000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极 大的方便。构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯 化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入 克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得 到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到 插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。2.材料方法2.1目的DNA的获得2.1.1引物设计第一次引物设计：正向引物：sinn3F 冰盒标注：P.2a引物序列：5 一 AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA-3 引物长度：25

5、bp反向引物：sinn3R冰盒标注：P仆2b引物序列：5一 GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA3引物长度：22bp第二次引物设计（带酶切位点）：正向引物：sinn3FE 冰盒标注：P.2c引物序列：5 一 ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGT3 引物长度：34bp反向引物：sinn3RE 冰盒标注：P由2d引物序列：5 一 TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT3引物长度：34bp2.1.2 PCR 扩增2.1.2.1 PCR技术的基本原理PCR即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶的催化下,以母链DNA为模板，以特定引物

6、为延伸起点，通过变性、延伸、复性等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA 的过程.是一项DNA体外合成放大技术,可用于基因分离克隆，序列分析,基因表达调控，基因 多态性研究等许多方面.PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2PCR反应的基本步骤：1. 变性：高温使双链DNA解离成单链.（94c 30s）2. 退火:低温下引物与模板DNA互补区结合形成杂交分子.（55c 30s）3. 延伸:中温延伸.在DNA聚合酶、dNTP、Mg2存在下，DNA聚合酶催化以引物为起 始点的DNA链5向3方向的延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链.（70-

7、72c 30-60s）以上三个步骤为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板，经过n次循环后,目的DNA以2n形式增加.2.1.2.2 PCR 检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染 色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体 等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法2.1.2.3 PCR反应体系第一次PCR扩增：调整PCR反应体系中各成份、组成及反应条件，经多次反复试验结 果得出下面的体系可得到清晰明亮的目的DNA电泳条带（1kb）:PCR反应体系2*100ul （每管25ul

8、,共8管）Pyrobest2ulbuffer （ 10x）10ulWT4 （模板）2ulP2（10uM）4ulP2b（10uM）4uldNTP（2.5x）2ulddHO76ul2PCR反应条件：94C 5min30 cycles: 94C 40s53C 40s4C forever将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳（方法见2.1.3电泳），切胶回 收目的DNA条带，共切3管,分别标注A、B、C.首先用25ul约60C的 无菌蒸馏水洗脱A管一次，洗脱液标注1,分别用15ul的无菌蒸馏水 洗脱B管和C管,得到的DNA洗脱液标注2,最后各用30ul的无菌蒸 馏水洗脱A、B、C管,得到的DNA洗脱液分别标注a

9、、b、c.第二次PCR扩增（带酶切位点）：分别用DNA的洗脱液2、a、b、c为模板，进行第二次PCR扩 增,设计反应体系（各25ul）如下：模板2模板a模板b模板cPyrobest0.5ul0.5ul0.5ul0.5ulbuffer (10x)2.5ul2.5ul2.5ul2.5ul模板0.5ul2ul4ul6ulP2 (10uM)1ul1ul1ul1ulP2b (10uM)1ul1ul1ul1uldNTP (2.5x)0.5ul0.5ul0.5ul0.5ulddHO19ul17.5ul15.5ul13.5ul2PCR反应条件：94C 5min30 cycles: 94C 40s54C 40s

10、72C 10min4C forever电泳结果表明：以2管和c管为模板可得到明显的目的基因条带， 依据此次电泳结果,可先后再利用PCR扩增（各100ul,每管25ul,共 8管）PCR反应体系2*100ul （每管25ul,共8管）模板2模板cPyrobest2ul2ulbuffer (10x)10ul10ul模板4ul40ulP2 (10uM)4ul4ulP2b (10uM)4ul4uldNTP (2.5x)2ul2ulddHO274ul38ulPCR反应条件：94C 5min30 cycles: 94C 40s54C 40s72C 2min30s72C 10min4C forever电泳条

11、带明显而且明亮,切胶回收保存待用.2.1.3 电泳2.1.3.1 配胶 配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(IX TAE Buffer) 根据制胶量和凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉(1g)，加入适当 的锥形瓶中。 加入一定量的电泳缓冲液(1X TAE Buffer 100ml)。 熔化完全，冷却至600C左右，加入EB5-7ul，充分混匀。 将溶液倒入制胶模中，之前应在适当位置插上梳子。 室温下凝固，不立即使用时，可用保鲜膜将凝胶包好后放40C 保存，一般可保存2-5天。2.1.3.2 电泳取适量的PCR产物与适量的漠酚蓝混合混匀后加入凝胶槽中， 另取适量的DNA Maker加入右边槽中，开始电泳。2

12、.1.3.3紫外观察电泳条带当漠酚蓝跑到适当位置时，在紫外光下观察目的基因的电泳条 带(1kb处)2.1.4切胶回收目的DNA切胶回收目的DNA的方法步骤：操作流程见右图，全套操作约需30分钟，详细说明如下。1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应 注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。注）切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。

13、4.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1以诞行计算。凝胶浓度DR-I Buffer 使用量5.向1.0%3个凝胶体积量胶1.0% 1.5%4个凝胶体积量块1.5% 2.0%5个凝胶体积量中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如 下表：6. 均匀混合后75C加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶 只需在45C加热）。此时应间断振荡混合，使胶块 充分融化（约610分钟）。注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响DNA 的回收率。7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1 /2体 积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分离小于400 b

14、p 的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20% 的异丙醇。8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube 上。9. 将上述操作7的溶液转移至Spin Column中，3,600 rpm离心1分钟（如Spin Column中有液体残留，可 适当提高离心速度，再离心1分钟），弃滤液。Spin至 ml TubefnElutlon Buffer口丽海湎注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可 以提高DNA的回收率。10. 将 500 pl 的 Rinse A 加入 Spin Column 中，3,600 rpm 离心 30 秒，弃滤液。11. 将 70

15、0 pl 的 Rinse B 加入 Spin Column 中，3,600 rpm 离心 30 秒，弃滤液。12. 重复操作步骤11，然后12,000 rpm再离心1分钟。13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25 pl的60C水或洗脱液，室温静置1分钟。14.12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。2.1.5 目的DNA加尾用25ul的无菌蒸馏水洗脱DNA，再用20ul的无菌蒸馏水洗脱，共得约40ul的洗脱液，然后抽真空使其浓缩至约8ul。加尾10ul体系：8ulDNA1ulBuffer (10x)0.5uldATP0.5u

16、lTaq酶PCR条件：72c 30-40min降至4C即可2.1.6 连接 T-DNA连接10ul体系：1 ulT4 ligase1 ulBuffer (10x)1 ulT-DNA7 ulDNA-PolyA连接条件：4000rpm甩30sec4c过夜2.2感受态DH5a的制备2.2.1基本原理转化是将外源DNA分子引入受体细菌,使之获得新的遗传性 状.受体细菌一般是限制修饰系统缺陷的变异株，不含限制性内切酶 和甲基化酶的突变体，可以容忍外源的DNA分子进入体内并稳定地遗 传给后代，受体细胞经过一些特殊的方法,如电击、CaCl2等化学试剂处 理后,细胞膜的通透性增加，成为感受态细胞，使外源的DN

17、A分子可以 进入.2.2.2方法步骤目前常用的感受态细胞制备方法有电击法和CaCl2法，电击法制 备效率较高，但CaCl2法简单易行，且其转化效率可以满足一般的实验 要求，因此CaCl2法使用更为广泛.CaCl2法制备感受态大肠杆菌的方法步骤：准备：（1）配制0.05mol/l的C Cl-15%的甘油混合溶液，高温 a 2高压灭菌.注：CaCl2必须为分析纯以上，（2）实验中所需要的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子 水彻底清洗干净，高温高压灭菌.注:最好有用于制备感受态细胞的 一套专用器材.（3）受体菌的培养:从非选择性LB培养基上挑取E.coli单菌落， 接种于3-5ml LB液体培养

18、基中，37振荡培养过夜至对数生长期中 后期.将该菌悬液以1:100的比例接种于50-100ml LB培养基中， 37C振荡培养2.5小时至OD600=0.5.注:培养时间不宜超过2.5小时, 否则不能达到最高转化效率.实验步骤：(1) 细菌的收获:培养液冰浴5分钟后,4C5000rpm离心5分钟.(2) 用欲冷的去离子水洗涤沉淀，4C5000rpm离心5分钟.(3) 沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的C Cl -15%的甘油混合溶a 2液,轻吹散，冰浴5分钟，0.05mol/l的CaCl2-15%的甘油混合溶液(4) 沉淀加入2ml欲冷的0.05mol/l的C Cl -15%的甘油混合溶

19、a2液,轻吹散，即成为感受态细胞悬液.分装成50-100ul的小份，置于-70C可保存半年.注:最好在两个月内用完,然后重新制备.若要进一步提高转化效率，可将加入的溶液体积减少到1ml或分装成200ul/管.电转化法制备感受态大肠杆菌的方法步骤：(1) 前夜接种受体菌(DH5a)，挑取单菌落于LB培养基中37C 摇床培养过夜.(2) 取2ml过夜培养物接种于200ml LB培养基中，37C摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.5 (约2.5-3小时).(3) 将菌液迅速置于冰上，以下步骤务必在超净工作台和冰上操作.(4) 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟.(5)

20、 4C3000rpm冷冻离心5分钟(6) 弃去上清，加入1500ul冰冷的10%甘油,用移液枪上下吸动打匀，使细胞重新悬浮.(7) 4C3000rpm冷冻离心5分钟(8) 弃去上清，加入750ul冰冷的10%甘油,用移液枪上下吸动打匀, 使细胞重新悬浮.(9) 4C3000rpm冷冻离心5分钟(10) 加入20ul冰冷的10%甘油，用移液枪上下吸动打匀，使细胞重 新悬浮.(11) 立即使用或迅速置于-70C超低温保存.2.3转化2.3.1基本原理感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的 细胞才能稳定摄取外来的DNA分子.PUC18的LacZ基因区域当有 DNA片段插入时，Lac

21、Z基因失活，转化进入大肠杆菌并在含有IPTG 和X-gal生长时会产生白色的克隆，不含插入片段的PUC18质粒进入 宿主细胞，生成蓝色菌落.2.3.2方法步骤(1) 在已制好的LB液体培养基(各250ml)中分别加入氨苄青 霉素250ul和卡那霉素500ml,摇匀后倒无菌平板，各倒7个，待凝固.(2) 用无水乙醇清洗浸泡在75%乙醇中的电击杯,于超净工作台 桑吹干或烘箱中烘干.将连接产物和0.1CM的电击被杯一起置于冰上 预冷.准备3管800ul的无抗LB,于冰上预冷.(3) 从-70C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻.(4) 取3ul连接产物加入到50-100ul感受态细胞中，混匀后转入 电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电击杯的底部.(5) 打开电转仪，将电击杯放入.(6) 按一下Pulse键,听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800ul 的LB培养基，重新悬浮细胞后,转移到1.5ml的离心管中.(7) 37C,100rpm 复苏 1T.5h(8) 5000rpm 离心 5 分钟,弃上清剩 100ul,取 10-50ul (40ul)涂 板，放于37C过夜培养.次日查看转化结果.2.4双酶切连接3.结果讨论参考文献Abstract附录致谢