玉米蛋白资源高效利用开发抗氧化肽的关键技术研究毕业论文

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1、分 类 号： TS201 单位代码：10183研究生学号： 2011872021 密 级：公 开 吉 林 大 学硕士学位论文玉米蛋白资源高效利用开发抗氧化肽的关键技术研究Key technologies of efficient utilization of Corn gluten meal todevelop antioxidative peptides作者姓名： 专 业：食品科学研究方向：营养与功能食品指导教师： 培养单位：军需科技学院2014年6月 玉米蛋白资源高效利用开发抗氧化肽的关键技术研究 Key technologies of efficient utilization of C

2、orn gluten meal to develop antioxidative peptides作者姓名：王可专业名称：食品科学指导教师：林松毅 教授学位类别：工学硕士答辩日期：2014年6月5日 中文摘要玉米蛋白资源高效利用开发抗氧化肽的关键技术研究本论文研究内容隶属于“十二五”国家科技支撑计划课题食源性功能肽生物制备技术研究（2012BAD33B03），是以蛋白质含量为79.4 %、粒径为180目的玉米蛋白粉为原料，重点开展了高效水解玉米蛋白粉的关键技术、高活性玉米抗氧化肽（CAPS）的优选、高活性玉米抗氧化肽（CAPS-1）的安全毒理学评价、玉米抗氧化肽（CAPS-1）分离制备高活性因

3、子、基于高压脉冲电场技术（PEF）提高玉米抗氧化肽活性等研究工作，具体研究内容如下：（1）在高效水解玉米蛋白粉的关键技术研究中，以水解度（DH）为衡量指标，借助单因素实验和响应面实验设计等研究方法，对比分析了碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶3种蛋白酶对玉米蛋白粉酶解过程中的DH的影响情况。通过对酶解温度T、酶解pH值、酶比底物浓度E/S的单因素实验对比分析获知，碱性蛋白酶酶解制备玉米蛋白粉酶解物的DH最高。通过响应面实验设计，构建了碱性蛋白酶回归模型为Y=36.85333-1.48375X1-9.94125X2+1.12X3-0.5225X1X2+0.78X1X3-0.31X2X3+0.02

4、4583X12- 11.8954X22-1.74292X32，式中：X1为酶解温度（）；X2为酶解pH值；X3为酶比底物浓度E/S（%）。其最佳工艺参数为：酶解温度50 ，酶解pH值8.6，酶比底物浓度9.13 %，玉米蛋白粉的最大水解度可达40.26 0.23 %；在此基础上探讨了辐照剂量（0-138.7 kGy）对玉米蛋白粉酶解过程中DH的影响，获知当辐照剂量为65.0 kGy时，玉米蛋白粉的DH可达最高值48.23 6.1 %，经场发射扫描电镜检测辐照前后玉米蛋白粉表面形态变化，获知较未辐照玉米蛋白粉相比，辐照剂量为65.0 kGy的玉米蛋白粉表面的凹凸程度增加，完整性下降。关键词：玉米

5、蛋白粉，玉米抗氧化肽，电子束辐照技术，高压脉冲电场技术IIAbstractKey technologies of efficient utilization of Corn gluten meal to develop antioxidative peptidesKey technologies of efficient utilization of Corn gluten meal to develop antioxidative peptides were granted by the National Science and Technology Pillar Program durin

6、g the 12th Five-year Plan Period (No. 2012BAD33B03). Corn gluten meal (protein content of 79.4%, sieving mesh of 180) were used as raw material. The key technologies of high efficient hydrolysis of Corn gluten meal, optimization of Corn antioxidant peptides (CAPS) with high activity, toxicological s

7、afety evaluation of CAPS with high activity, preparation of high active of CAPS, and the technology of pulsed electric field (PEF) improving the activity of CAPS were researched. The specific research content as follows:Key words: Corn gluten meal, CAPS,Electron beam radiation, PEF technology I目 录第1

8、章 绪论11.1 玉米蛋白粉的综合利用现状分析11.1.1 玉米蛋白粉的组成11.1.2 玉米蛋白粉的营养价值11.1.3 玉米蛋白粉的应用现状21.2 食源性抗氧化肽的研究进展31.2.1 大豆源抗氧化肽31.2.2 水产源抗氧化肽31.2.3 蛋源抗氧化肽31.2.4 玉米源抗氧化肽41.3 影响抗氧化肽活性的高新技术的研究现状41.3.1 超声波技术41.3.2 微胶囊技术41.3.3 高压脉冲电场技术51.4 辐照技术在功能食品领域中的研究现状51.5 本文主要研究内容61.5.1 研究内容61.5.2 研究路线6第2章 高效水解玉米蛋白粉的关键技术研究82.1 材料与设备82.1.1

9、 材料与试剂82.1.2 仪器与设备82.2 实验方法92.2.1 玉米蛋白粉的酶解方法92.2.2 水解度测定方法92.2.3 蛋白酶可控酶解技术的单因素实验设计102.2.4 蛋白酶可控酶解技术的响应面实验设计102.2.5 电子束辐照技术对玉米蛋白粉水解度的影响112.2.6 场发射电子扫描实验112.2.7 数据分析方法112.3 结果与分析122.3.1 单因素实验结果122.3.2 响应面优化实验结果162.3.3 不同辐照剂量对玉米蛋白粉水解度的影响192.3.4 场发射电子扫描结果分析202.4 讨论212.5 本章小结22第3章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS-1）的优选233

10、.1 材料与设备233.1.1 材料与试剂233.1.2 实验动物233.1.3 仪器与设备243.2 实验方法243.2.1 超滤分离技术243.2.2 DPPH清除率的测定方法253.2.3 体内抗氧化活性评价方法253.2.4 氨基酸成分及含量分析263.2.5 数据处理与分析方法263.3 结果与分析273.3.1 超滤液各组分的DPPH清除率测定结果273.3.2 体内抗氧化活性评价结果273.3.3 氨基酸成分及含量分析293.4 讨论303.5 本章小结31第4章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS-1）的安全毒理学评价324.1 材料与设备324.1.1 材料与试剂324.1.2 实

11、验动物324.1.3 仪器与设备324.2 实验方法334.2.1 实验动物饲养与分组334.2.2 受试小鼠精子畸形率的测定方法334.2.3 受试小鼠的骨髓微核率测定方法344.2.4 受试小鼠的NK细胞活性检测方法344.2.5 受试小鼠的脏器系数检测方法344.2.6 受试小鼠的体重均值、日摄食量和日饮水量监测方法344.2.7 数据处理与分析方法344.3 结果与分析354.3.1 CAPS-1不同受试剂量对小鼠精子畸形率和骨髓微核率的影响354.3.2 CAPS-1不同受试剂量对受试小鼠的NK细胞活性的影响354.3.3 CAPS-1不同受试剂量对受试小鼠的脏器系数的影响364.3

12、.4 CAPS-1不同受试剂量对受试小鼠的体重的影响364.3.5 CAPS-1不同受试剂量对受试小鼠日摄食量和饮水量的影响374.4 讨论374.5 本章小结38第5章 玉米抗氧化肽（CAPS-1）分离制备高活性因子的研究405.1 材料与设备405.1.1 材料与试剂405.1.2 仪器与设备405.2 实验方法415.2.1 CAPS-1的最大吸收波长测定415.2.2 CAPS-1的Sephadex G-25凝胶色谱分离方法415.2.3 DPPH清除率的测定方法415.2.4 氨基酸成分及含量分析415.2.5 数据处理与分析方法425.3 结果与分析425.3.1 CAPS-1的最

13、大吸收波长检测结果425.3.2 CAPS-1的Sephadex G-25凝胶色谱分离图谱分析425.3.3 DPPH清除率测定结果435.3.4 氨基酸成分及含量分析结果445.4 讨论445.5 本章小结45第6章 基于高压脉冲电场技术提高玉米抗氧化肽活性的研究466.1 材料与设备466.1.1 材料与试剂466.1.2 仪器与设备466.2 实验方法466.2.1 高压脉冲电场处理实验466.2.2 单因素实验设计476.2.3 响应面实验设计476.2.4 DPPH清除率的测定方法476.2.5 中红外光谱（MIR）分析486.2.6 数据处理与分析方法486.3 结果与分析486.

14、3.1 PEF的单因素实验结果486.3.2 PEF的响应面实验结果506.3.3 MIR分析结果536.4 讨论536.5 本章小结54第7章 结论557.1 全文结论557.2 创新点56参考文献58导师简介64作者简介65在学期间所取得的科研成果66致 谢68英文缩略词表英文缩写英文名称中文名称DHDegree of Hydrolysis水解度SPSSStatistical Package for Social Science社会科学统计软件包OFATOne-factor-at-a-time单因素实验设计RSMResponse Surface Methodology响应面分析法BBDBo

15、x-Behnken DesignBox-Behnken 设计SDStandard Deviation标准差DPPH1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl1,1-二苯基-2-三硝基苯肼CAPSCorn Antioxidative Peptides玉米抗氧化肽LDLow Dose低剂量MDMiddle Dose中剂量HDHigh Dose高剂量GSH-PxGlutathione Peroxidase谷胱甘肽过氧化物酶SODSuper Oxide Dismutase超氧化物歧化酶MDAMalondialdehyde丙二醛CATCatalase过氧化氢酶PEFPulsed Ele

16、ctric Field高压脉冲电场EWAPSEgg White Antioxidative Peptides蛋清抗氧化肽MIRMid-infrared中红外光谱分析第1章 绪论 第1章 绪论1.1 玉米蛋白粉的综合利用现状分析玉米是我国的传统粮食作物，分布范围广，营养价值丰富，2013年产量已超过2.1亿吨，而且种植面积将继续扩大。近年来，我国玉米深加工行业取得了飞速发展，一系列玉米加工副产物在我国食品工业和畜牧业中的地位也越来越重要，玉米蛋白粉即属于其中之一。玉米蛋白粉是玉米籽粒经湿磨法工艺生产玉米淀粉所产生的副产物，产量占总产品的30 %左右1,2。但是由于玉米蛋白粉的水溶性差、口感粗糙、

17、利用率低、营养价值低等不足，限制了其在食品工业中的应用，大多被用于饲料或作为废弃物排掉3。一直以来，如何提高玉米蛋白粉的利用率和附加值成为了食品工业的研究热点，这对于玉米产业的综合开发利用有着重要意义。1.1.1 玉米蛋白粉的组成玉米蛋白粉中含蛋白质60 %左右，含淀粉20 %，以及少量的纤维素和维生素A，通常含15种无机盐和玉米黄色素4,5。玉米蛋白粉中的蛋白在机体内呈现两种不同状态，即可溶性蛋白质和不可溶性蛋白质6。可溶性蛋白质在机体内分解、转化，表现出一定的生理功能性；不可溶性蛋白质易和大分子有机物或微量元素结合，不易被机体吸收利用。玉米蛋白粉中淀粉分为抗性淀粉和慢消化淀粉两种，抗性淀粉

18、在小肠中不能被酶解，但在人的肠胃道结肠中可以与挥发性脂肪酸发生发酵反应；慢消化淀粉在小肠中黏滞性增大，被消化吸收速度较慢。所以如何改良淀粉和蛋白质特性是玉米蛋白粉精深加工的主要研究问题。1.1.2 玉米蛋白粉的营养价值玉米蛋白粉中的蛋白质主要为醇溶蛋白和谷物蛋白，另有少量的球蛋白和白蛋白7。醇溶蛋白可溶于70 % - 80 %的乙醇，谷蛋白可溶于稀酸或稀碱，球蛋白不溶于水但溶于盐，白蛋白又称清蛋白，可溶于水8。玉米蛋白粉水解后可分解得到谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸等9，其中亮氨酸和谷氨酸的含量较多，赖氨酸和色氨酸含量较低，其他几种必需氨基酸含量也较低。由于这种独特的氨基酸组成，造成玉米蛋白

19、粉的营养价值不高，但是通过生物工程和化学技术可以对玉米蛋白粉进行二次利用。目前的研究热点在于，控制酶解技术可获得具备多种生理功能的玉米源活性肽。1.1.3 玉米蛋白粉的应用现状（1）用作饲料蛋白原料玉米蛋白粉不含有毒有害物质，可以直接作为饲料蛋白原料。玉米蛋白粉饲料可替代豆饼和菜粕，通常作为家禽配合饲料的主要组分。饲喂玉米蛋白粉的蛋鸡产蛋率可提高15 %左右，能够防治蛋鸡的软骨病和其他疾病，有助于提高蛋白品质。用玉米蛋白粉饲喂牛，可以使在瘤胃中不易被消化的蛋白质能在小肠中被更好地吸收10。（2）制备谷氨酰胺肽谷氨酰胺是一种氨基酸类药物，可用于治疗胃肠性疾病和免疫性疾病。研究人员发现，谷氨酰胺一

20、般聚集于玉米醇溶蛋白，而玉米蛋白主要由醇溶蛋白构成，所以可由玉米蛋白粉制得谷氨酰胺肽。当机体内谷氨酰胺含量不足时，可以通过体外的谷氨酰胺肽进行补给，利用低价值的玉米蛋白粉制备高价值的谷氨酰胺肽是玉米蛋白粉深加工一条新途径11。（3）制备玉米醇溶蛋白研究发现，玉米醇溶蛋白具有独特的溶解性、成模性和生物活性，可用于防潮、抗氧化、保鲜、防静电等。利用成膜性，玉米醇溶蛋白还可作为药物制剂的辅料。近年来有研究报道，玉米醇溶蛋白的制备方法已经由过去的异丙醇提取法发展为乙醇提取法。也有研究应用超声波技术和萃取技术，并优化获得醇溶蛋白的提取工艺，可以提高生产效率12。（4）制备玉米黄色素玉米蛋白粉经水解、萃取

21、、蒸发浓缩等操作能够制备玉米黄色素。适宜的蛋白酶水解条件和酶解物处理能够提高玉米黄色素得率，增效剂的配合使用能够影响玉米黄色素的光密度值13。段纯明等研究了通过挤压膨化技术处理玉米蛋白粉可以提高玉米黄色素的提取率14。而且玉米蛋白粉的酶解温度、水解时间和pH值也会影响玉米黄色素的提取率15。（5）制备玉米蛋白肽近期研究发现，玉米蛋白粉可用以制备高F值低聚肽、降血压肽和抗氧化肽等蛋白肽。高F值低聚肽的消化吸收性优于蛋白质与氨基酸，可以作为肠道营养剂。随着相关研究的逐步深入，高F值低聚肽的生产与应用为玉米蛋白粉的精深加工开辟了新方向。玉米蛋白粉具有独特的氨基酸组成，能够满足血管紧张素转换酶（ACE

22、）抑制肽的氨基酸特征，可制备获得降血压肽16,17。何慧等研究报道，玉米大豆复配蛋白可以制备获得降血压肽，而且中性蛋白酶是酶解蛋白的最适宜酶18。国内外研究表明，玉米源抗氧化肽的活性受酶解条件、蛋白酶种类和底物特性的影响较大。有研究证实，玉米抗氧化肽的活性测定方法较为普遍，多数以自由基清除率为考察指标19。王双玉研究报道，底物浓度为8 %，E/S为2 %，pH值为9.0，时间为3 h，温度为55 时，玉米抗氧化肽对氧自由基（O2-）和羟自由基（OH）具有很强的清除能力20。32第3章 高活性玉米抗氧化肽（CAPS-1）的优选第2章 高效水解玉米蛋白粉的关键技术研究在高效水解玉米蛋白粉的关键技术

23、研究中，以水解度（DH）为衡量指标，将借助单因素实验和响应面实验设计等研究方法，对比分析碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶3种蛋白酶对玉米蛋白粉酶解过程中的DH的影响情况，获得高水解度玉米蛋白酶解物的最佳工艺参数；在此基础上，本文将首次开展电子束辐照技术对玉米蛋白粉酶解效果的研究，重点分析不同辐照剂量（0-138.7 kGy）处理玉米蛋白粉后对其水解度的影响，拟设计一条水解度为40 %以上的玉米蛋白粉酶解技术的工艺路线，为后期玉米蛋白粉的综合利用开发功能肽提供技术支撑。2.1 材料与设备2.1.1 材料与试剂玉米蛋白粉（经180目筛选，蛋白质含量79.4 %）：购买于长春大成集团；1,1-二苯

24、基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH）：分析纯，购买于Sigma 公司；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶（酶活20万U/g）：食品级，购买于南宁庞博生物工程有限公司；甲醇、氢氧化钠、盐酸：均为分析纯，购买于北京化工厂。2.1.2 仪器与设备ESJ60-4电子天平：沈阳龙腾电子有限公司；电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；DK-8D恒温水浴槽：上海精宏实验设备有限公司；Starter-300便携式pH计：上海奥豪斯仪器有限公司；JJ-1型精密增力电动搅拌器：金坛荣华仪器制造有限公司；单道移液器（200 L，1000 L）：北京东林昌

25、盛生物科技有限公司；CR20B2型离心机：日本日立工机公司；MH-2型微量振荡器：江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；RT-6000酶标仪：美国雷杜公司；10Mev/15KW辐照电子直线加速器：长春易孚辐照加速器有限公司；JSM-6700F场发射扫描电子显微镜：JEOL日本电子公司。2.2 实验方法2.2.1 玉米蛋白粉的酶解方法 2.2.2 水解度测定方法水解度（DH）是衡量水解反应中，蛋白质水解达到平衡后肽键被酶切断的情况，通过测定水解度可以优选最适宜蛋白酶和最佳酶解条件。测定方法采用 pH-stat 法50,51，pH-stat法较甲醛滴定法操作简单方便，实验结果准确性高52。底物蛋白在不

26、同 pH 环境下解离状态不同，酶解后可以产生自由羧基、氨基和氨基酸残基，所释放的氨基酸能改变酶解液 pH值，用1M的NaOH或HCl滴定回原pH值，根据计量消耗的酸液或碱液体积，即可知道肽键被酶切断的数目，计算得到单位质量蛋白质中被酶解的肽键数占总肽键数的百分比即为水解度53，计算公式如下： （公式2.1）；式中：h被水解的肽键数；V酸或碱的滴定量 (mL)；C酸或碱的浓度 (mol/L)；Mp参加水解的蛋白质总量 (g)；htot每克蛋白质中肽键的克当量数（对于玉米蛋白取7.35 mmol/g）；氨基酸的平均离解度。2.2.3 蛋白酶可控酶解技术的单因素实验设计为了筛选玉米蛋白酶解技术的最优

27、蛋白酶，选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶分别酶解玉米蛋白粉。由于酶解温度、pH值和酶与底物浓度比三个因素对酶解效果和产物的影响较为显著54。因此，依次考察了酶解温度（T）、酶解pH值、酶与底物浓度比（E/S）对玉米蛋白粉DH的影响，单因素实验设计方案如表2.1所示：表2.1 单因素实验设计表Table 2.1 Design of One-factor-at-a-time experiment酶种类因素水平123456碱性蛋白酶酶解温度（）404550556065酶解pH值67891011E/S（%）24681012中性蛋白酶酶解温度（）253035404550酶解pH值55.566.57

28、7.5E/S（%）24681012木瓜蛋白酶酶解温度（）404550556065酶解pH值456789E/S（%）246810122.2.4 蛋白酶可控酶解技术的响应面实验设计利用响应面软件Design-Expert 8.0 中的BBD实验设计进行优化分析。根据单因素实验结果和BBD中心组合实验原理，为最优蛋白酶设计三因素三水平响应面优化实验55。建立二次回归模型，用不失拟的回归方程确定最优工艺参数，决定最优响应因子水平56。自变量X1（酶解温度）、X2（酶解pH值）、X3（E/S）的三个水平编码表如表2.2，回归方程的二次模型如下：式中：y是响应值；0是截距，j、jj和ij分别代表线性、平方

29、和交互作用系数；Xi和Xj代表自变量。表2.2 响应面实验因素水平表Table 2.2 Factors and levels of RSM因素编码编码水平-101酶解温度（）X1505560酶解pH值X28910E/S（%）X389102.2.5 电子束辐照技术对玉米蛋白粉水解度的影响以玉米蛋白粉为原料，分别经0 kGy 、9.0 kGy、36.8 kGy、65.0 kGy、108.7 kGy、135.0 kGy和138.7 kGy 8个辐照剂量进行电子束辐照处理，依次在适宜蛋白酶的最佳酶解条件下进行可控酶解处理，以DH作为衡量指标，检测不同辐照剂量对玉米蛋白粉水解度的影响。2.2.6 场发射

30、电子扫描实验利用场发射扫描电子显微镜（JSM-6700F，JEOL日本电子公司）对辐照处理前后的玉米蛋白粉进行电镜扫描，可以反映辐照处理对玉米蛋白粉表面微观结构的影响。2.2.7 数据分析方法利用SPSS 17.0 软件对实验数据进行方差分析和显著性检验，结果用平均数标准偏差（x S.D.）表示，显著性水平为P0.05。2.3 结果与分析2.3.1 单因素实验结果以DH作为衡量指标，对温度T（）、pH值和酶比底物浓度 E/S（%）三个因素影响三种蛋白酶的酶解效果情况汇总分析，结果如图2.1所示。（1）酶解温度对DH的影响酶解温度对DH的影响如图2.1所示，在可控酶解条件下，碱性蛋白酶的酶解效果

31、理想，DH能够达到40 %以上。（a）碱性蛋白酶（b）中性蛋白酶（c）木瓜蛋白酶图2.1 酶解温度对DH的影响Figure 2.1 Effects of temperature on DH注：不同小写字母代表差异性显著（P0.05）。如图2.1（a）所示，温度对其DH影响显著（P0.05），随着温度升高，DH逐渐上升，在60 时达到最高值37.89 2.89 %，继续升高至65 时，DH显著下降（P0.05）。中性蛋白酶的单因素实验结果如图2.1（b）所示，比较于碱性蛋白酶，其酶解物的DH较低，当酶解温度由25 升至30 时,DH显著升高（P0.05），最高值达到3.21 0.21 %，随着温

32、度继续升高，DH逐渐下降。木瓜蛋白酶的单因素结果如图2.1（c）所示，同样，相比于碱性蛋白酶，其酶解物的DH较低，随着温度升高，DH显著增加（P0.05），在60 时，DH达到最高值6.56 0.5 %。（2）酶解pH值对DH的影响pH值对DH的影响如图2.2所示，碱性蛋白酶的单因素结果如图2.2（a），DH随着pH值的升高先增加后再减少，变化显著（P0.05），pH值为9时DH达到最高值40.81 0.8 %，符合碱性蛋白酶的应用pH环境，所以选择pH值为9进行之后的优化实验。中性蛋白酶的单因素结果如图2.2（b）所示，随着pH值的逐渐增加，DH显著增加（P0.05），在pH为7时达到最大值

33、1.81 0.08 %，可以选取pH=7进行后续实验。木瓜蛋白酶的单因素结果如图2.2（c）所示，随着pH的增加，DH显著增加（P0.05），当pH=9时达到最高值14.26 0.61 %。（a）碱性蛋白酶（b）中性蛋白酶（c）木瓜蛋白酶图2.2 pH值对DH的影响Figure 2.2 Effects of pH value on DH注：不同小写字母代表差异性显著（P0.05）。（3）酶比底物浓度对DH的影响酶比底物浓度对酶解物DH的影响如图2.3所示，由图2.3（a）可知，碱性蛋白酶酶解物随着E/S的增加DH显著增加（P0.05），在E/S为12 %时达到最大值38.31 0.8 %。中性

34、蛋白酶的单因素实验结果如图2.3（b）所示，E/S的增加对DH的影响为先增加后降低。E/S为10 %时DH达到最大值1.6 0.09 %。由图2.3（c）可知，木瓜蛋白酶酶解物DH受E/S的影响变化显著，当E/S升至10 %时，DH达到最高值6.66 0.1 %。（a）碱性蛋白酶（b）中性蛋白酶（c）木瓜蛋白酶图2.3 E/S对DH的影响Figure 2.3 Effects of E/S on DH注：不同小写字母代表差异性显著（P0.05）。（4）单因素实验的最优工艺参数根据单因素实验结果分析，碱性蛋白酶酶解物的水解度高于其他两种酶，因此碱性蛋白酶可以作为水解玉米蛋白的最优蛋白酶，三种酶的单

35、因素实验最优工艺参数如表2.3所示：表 2.3 单因素实验优化工艺参数Table 2.3 Optimized independent levels of OFAT酶种类酶解温度（）酶解pH值E/S (%)碱性蛋白酶60912中性蛋白酶30710木瓜蛋白酶609102.3.2 响应面优化实验结果根据单因素实验结果，选用碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉，以DH为指标，考察酶解温度，酶解pH值和E/S对DH的影响情况，进行三因素三水平响应面BBD实验，设计方案和结果如表2.4所示。（1）回归模型构建与检验结果以DH为响应值，利用Design-Expert 8.0软件对表2.4的实验结果进行统计分析，并构建回

36、归模型，分别得到回归方程如下：Y=36.85333-1.48375X1-9.94125X2+1.12X3-0.5225X1X2+0.78X1X3-0.31X2X3+0.024583X12- 11.8954X22-1.74292X32；式中：自变量X1为酶解温度（）；自变量X2为酶解pH值；自变量X3为E/S（%）。对响应值DH的三元二次回归模型进行方差分析，结果如表2.5所示：回归模型是显著的（PFModel1350.92150.117.31 0.0029*X117.6117.612.030.21X2790.63790.6391.160.0002*X310.0410.041.160.33X12

37、1.091.090.130.74X222.432.430.280.62X320.380.380.040.84X1 X20.000.000.000.99X1 X3522.47522.4760.240.0006*X2 X311.2211.221.290.31Residual43.378.67Lack of fit42.7614.2546.80.02*Corr. total1394.29注：R=0.9843; R2=0.9689; adjusted R2=0.9129; predicated R2=0.5084; adequate. precision = 108.187.*表示显著性水平为 P40

38、 %）。第6章 基于高压脉冲电场技术提高玉米抗氧化肽活性的研究第6章 基于高压脉冲电场技术提高玉米抗氧化肽活性的研究在基于高压脉冲电场技术（PEF）提高玉米抗氧化肽活性的研究中，将以CAPS-2和蛋清抗氧化肽（EWAPS）为实验原料，以DPPH清除率为衡量指标，将借助单因素和响应面实验设计方法，考察料液浓度、电场强度和电场频率对CAPS-2抗氧化活性的影响，构建PEF技术提高CAPS-2抗氧化活性的工程化回归模型，试图获得最佳工艺参数，并利用中红外分析（MIR）对电场处理前后的样品进行结构比较。6.1 材料与设备6.1.1 材料与试剂CAPS-2冻干粉：由第三章超滤和真空冷冻干燥制备；EWAP

39、S冻干粉：由吉林大学军需科技学院营养与功能实验室提供；DPPH：分析纯，购买于Sigma 公司；溴化钾：色谱级，购买于Sigma 公司；氢氧化钠、甲醇、无水乙醇：分析纯，购买于北京化工厂。6.1.2 仪器与设备LDT-200/10-20.1 PEF系统：长春华迪生物科技开发有限公司；ZG-2真空冷冻干燥机：杭州创意真空冷冻干燥设备厂；单道移液器（200 L，1000 L）：北京东林昌盛生物科技有限公司；MH-2型微量振荡器：江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；RT-6000酶标仪：美国雷杜公司；IR Prestige-21红外光谱仪：日本岛津公司。6.2 实验方法6.2.1 高压脉冲电场处理实验

40、根据前期相关研究方法85,86，将物料泵和PEF系统管路先后用蒸馏水和乙醇清洗两至三遍，分别取CAPS-2冻干粉和EWAPS冻干粉用蒸馏水配制成不同浓度的处理液，在室温环境下，用物料泵抽取处理液，使处理液以1.6 mL/min的流速在电场处理装置中循环流动。开启电场装置电源，将电场强度和电场频率设至所需参数，PEF处理时间为2-3 min，收集处理液放置于4 冰箱中备用。6.2.2 单因素实验设计以料液浓度、电场强度和电场频率作为PEF系统的主要因素，以DPPH清除率为衡量指标设计三因素三水平单因素实验，因素水平表如表6.1所示。检测料液浓度对DPPH清除率的影响时，三个水平分别为6 mg/m

41、L，8 mg/mL和10 mg/mL，恒定条件为：电场强度10 kV/cm，电场频率2000 Hz；检测电场强度对DPPH清除率的影响时，三个水平为5 kV/cm，10 kV/cm和15 kV/cm，恒定条件为：料液浓度10 mg/mL，电场频率2000 Hz；检测电场频率对DPPH清除率的影响时，三个水平为2000 Hz，2350 Hz和2700 Hz，恒定条件为：料液浓度10 mg/mL，电场强度10 kV/cm。以PEF对EWAPS的DPPH清除率影响情况作为对照，考察PEF对CAPS-2 DPPH清除率的影响作用。表6.1 因素水平设计表Table 6.1 Design of vari

42、abls and levels因素水平123料液浓度（mg/mL）6810电场强度（kV/cm）51015电场频率（Hz）2000235027006.2.3 响应面实验设计利用响应面软件Design-Expert 8.0 中的BBD实验设计进行优化分析，根据单因素实验结果和BBD中心组合实验原理，利用Design-Expert 8.0软件BBD模型选定三因素三水平进行响应面设计87，自变量X1（料液浓度）、X2（电场强度）、X3（电场频率）的三因素三水平编码表如表6.2：表6.2 响应面因素水平编码表Table 6.2 Factors and levels design of RSM因素编码水

43、平-10-1料液浓度（mg/mL）6810电场强度（kV/cm）51015电场频率（Hz）2000235027006.2.4 DPPH清除率的测定方法将PEF处理后的CAPS-2和EWAPS处理液进行真空冷冻干燥，收集冻干粉以供检测DPPH清除率，检测方法同3.2.2。6.2.5 中红外光谱（MIR）分析设置中红外检测器分辨率为4 cm1，测试范围为400-4000 cm1。将溴化钾在130 下干燥5-8 h，以备压片。将经PEF最优工艺参数处理后的CAPS-2进行真空冷冻干燥制成CAPS-2(PEF)冻干粉，将1 mg CAPS-2(PEF)冻干粉和200 mg溴化钾压片作为处理样，将200

44、 mg溴化钾压片作为空白样，将处理样和空白样在处理室内以2.8 mm/s的扫描速度自动识别，进行背景扫描和基线校正后获得MIR光谱图。6.2.6 数据处理与分析方法每个样品设三个平行，利用SPSS 17.0 软件对数据进行方差分析和显著性检验，结果均用平均数标准差（x S.D.）表示，利用Design-Expert 8.0软件中的BBD分析响应面实验的二次多项式模型的回归系数和响应值，显著性水平为P0.05），在浓度为8 mg/mL时DPPH清除率达到最高值81.2 0.79 %，当浓度增至10 mg/mL时，DPPH清除率显著降低（P0.05）；由图6.1（b）可知，当电场强度由0 kV/c

45、m增至5 kV/cm时，CAPS-2的DPPH清除率显著增加（P0.05），并达到最高值83.02 0.95 %，随着电场强度继续增加，DPPH清除率先显著下降（P0.05）后趋于稳定；由图6.1（c）可知，当电场频率由0 Hz增至2000 Hz时，CAPS-2的DPPH清除率显著增加（P0.05），在2000 Hz时达到最大值82.59 1.38 %。以PEF对EWAPS的DPPH清除率的影响情况作为对照，结果表明PEF处理对两种肽的DPPH清除率均有提高和稳定的作用，作用意义显著（P0.05），两种肽的DPPH清除率的变化趋势相同，最佳工艺参数也相同。经比较获知，CAPS-2的DPPH清除率较高于EWAPS的DPPH清除率。(a)(b)(c)图 6.1 PEF处理对DPPH清除率的影响Figure 6.1 Effects of PEF processing on DPPH inhibition注：小写字母代表CAPS-2的显著性，大写字母代表EWAPS的显著性；不同字母代表差异性显著（PFModel230.8925.651.890.25X145.1445.143.330.13X25.645.640.420.55X30.410.410.030.87