第二章基因工程的酶学基础

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1、第二章第二章 基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础主要内容第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶第二节第二节 DNA连接酶连接酶第三节第三节 DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶第四节第四节 DNA修饰酶修饰酶第五节第五节 外切核酸酶外切核酸酶第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶第七节第七节 RNA酶酶 补充：核酶补充：核酶 甲基化酶甲基化酶第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(Restriction(Restriction Endonuclease,REEndonuclease,RE)一、寄主的限制一、寄主的限制-修饰系统修饰系统(R-M,Restriction-m

2、odification system)大肠杆菌大肠杆菌B大肠杆菌大肠杆菌K修饰的修饰的phage (B)EOP=10-4（限制作用）（限制作用）EOP=10-4（限制作用）（限制作用）EOP=1（修饰作用）（修饰作用）修饰的修饰的phage (K)注：EOP=噬菌体的成斑率 第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 限制限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通：指一定类型的细菌可以通过限制性内切核酸酶（限制酶）的作用，破过限制性内切核酸酶（限制酶）的作用，破坏入侵的噬菌体坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。维护宿主遗传稳定的保护机制。度受

3、到限制。维护宿主遗传稳定的保护机制。第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 限制酶：限制酶：在细胞内能够识别双链在细胞内能够识别双链DNA分分子中的特定核苷酸序列，并对子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子分子进行切割的一种酶进行切割的一种酶。1978年，年，W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖。奖。第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 修饰修饰(modification)：指寄主本身的：指寄主本身的DNA，由于，由于在合成后通过甲基化酶（甲基

4、转移酶）的作用在合成后通过甲基化酶（甲基转移酶）的作用得以甲基化，使得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身得以修饰，从而免遭自身限制酶的破坏。限制酶的破坏。第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 寄主控制的限制与修饰的作用：一是保护自身的寄主控制的限制与修饰的作用：一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。使之迅速降解。基因工程中，应用采用缺少限制作用的菌株作为受基因工程中，应用采用缺少限制作用的菌株作为受体。体。例如例如K12：rk+mk+rk-mk-（用于转化实验）（用于转化实验）rk-mk

5、+（用于转化实验）（用于转化实验）rk+mk-（自杀性表型）（自杀性表型）第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 根据限制性内切核酸酶的识别切割特性、催化条件及是根据限制性内切核酸酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为否具有修饰酶活性，可分为、型四类。型四类。二、限制性内切核酸酶的类型二、限制性内切核酸酶的类型主要特性主要特性型型型型型型限制修饰限制修饰蛋白结构蛋白结构辅助因子辅助因子识别序列识别序列切割位点切割位点多功能（具甲基化）多功能（具甲基化）异源三聚体异源三聚体ATP Mg2+SAM距识别序列距识别序列1kb处处随机性切割随机性切割单一功能单一功能同源三聚体同

6、源三聚体Mg2+4-6bp回文序列回文序列特异切割特异切割双功能（具甲基化）双功能（具甲基化）异源二聚体异源二聚体ATP Mg2+距识别序列下游距识别序列下游24-26bp处处随机性切割随机性切割基因工程中广泛使用基因工程中广泛使用注：注：SAM为为S腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸REBASE 数据库数据库(http：/ 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母个字母的略语表示寄主菌的物种名。的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）用）用Eco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌

7、（Haemophilus influenzae）用）用Hin表示。表示。2.若该微生物有不同的变种或品系，再加上该变种或品若该微生物有不同的变种或品系，再加上该变种或品系的第一个字母，如系的第一个字母，如EcoR。3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制-修复系统，修复系统，用罗马字母表示，如用罗马字母表示，如EcoR，EcoR。4.限制酶前面要带上限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带，修饰酶前面要带上上M（Modification）。）。(现已省略现已省略)三、限制性内切核酸酶的命名三、限制性内切核酸酶的命名P14第一节第一节

8、限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 若种名头若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。一和第三个字母。EcoREscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(一一)识别序列的特异性识别序列的特异性 识别顺序的碱基数一般为识别顺序的碱基数一般为4-6bp，少数识别更长，多数，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位识别位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。点在切割位点之外，具旋转对称性。4bp Hpa CCGG GG

9、CC 5bpAva GGWCC CCWGG 6bp Sma CCCGGG GGGCCC11bp Bg1 GCCNNNNNGGC CGGNNNNNCCG N=A,T,G,C四、四、型限制性内切核酸酶的基本特性型限制性内切核酸酶的基本特性第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶1.DNA分子酶切片段的末端分子酶切片段的末端 型限制性内切核酸酶切割双链型限制性内切核酸酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键，水解磷酸二酯键中中3位酯键产生两个末端，末端结构是位酯键产生两个末端，末端结构是5-P和和3-OH，产生产生3种不同的切口种不同的切口。(二二)切割位点的特异性切割位点的特异性第一节第一节 限制性

10、内切核酸酶限制性内切核酸酶（1）5突出的黏性末突出的黏性末端端第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（2）3突出的黏性末突出的黏性末端端第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 黏性末端：指黏性末端：指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。P16nicknicks.nicknicks,第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（3）平末端）平末端 Pst I 5-CTGCAG

11、-3 5-CTGCAOH PG-3 3-GACGTC-5 3-GP HOACGTC-5EcoRI 5-GAATTC-3 5-GOH PAATTC-3 3-CTTAAG-5 3-CTTAAP HOG-5SmaI 5-CCCGGG-3 5-CCCOH PGGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGGP OHCCC-53-黏性末端黏性末端5-黏性末端黏性末端平末端平末端第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 指来源不同但识别相同靶序列的限制性内切指来源不同但识别相同靶序列的限制性内切核酸酶核酸酶。Sst CCGCGG Sac CCGCGG Kpn

12、GGTACC Asp718 GGTACC 区分区分：同切点酶或同裂酶：同切点酶或同裂酶、原型酶、新裂酶、原型酶、新裂酶2.同切点酶同切点酶(isoschizomer,同裂酶同裂酶)P17新裂酶新裂酶第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 指来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后指来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同黏性末端的限制性内切核酸酶能产生相同黏性末端的限制性内切核酸酶。P17 一组同尾酶：一组同尾酶：BamH(GGATCC)、Bcl(TGATCA)、Bgl(AGATCT)、Sau3A(GATC)和和Xho(RGATCY)同尾酶产生的同尾酶产生的DNA片段能通

13、过粘性末端之间的互补片段能通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，这在分子克隆中很有用。作用而彼此连接起来，这在分子克隆中很有用。重组后形成的序列一般不能被原来的任何一种同尾重组后形成的序列一般不能被原来的任何一种同尾酶所识别。酶所识别。3.同尾酶同尾酶(isocaudamer)第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 1 U核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，核酸内切酶的酶活性：在最适反应条件和温度下，保温保温1h，使，使1g DNA完全降解所需的酶量。完全降解所需的酶量。大部分大部分型限制性核酸内切酶需要相似反应条件型限制性核酸内切酶需要相似反应条件：Tris-HCl 50

14、mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-150mmol/L DTT(二硫苏糖醇二硫苏糖醇)1mmol/L Volume 20-100L Temperature 37 Time 1-1.5h 五、五、型限制性内切核酸酶的反应条件型限制性内切核酸酶的反应条件0-50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 高盐酶高盐酶Buffer第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 在灭菌的在灭菌的0.5mL离心管中进行限制性酶切反应：离心管中进行限制性酶切反应：20L体积反应体系，加样如下：体积反应体系，加样如下：DNA 0.2-1g 10酶切酶切buf

15、fer 2.0 L 限制性内切酶限制性内切酶 1-2 U（单位）（单位）加加ddH2O 至至 20 L 多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化；先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化；或者先一种酶切，然后更换缓冲液，另一种酶再切；又或者先一种酶切，然后更换缓冲液，另一种酶再切；又或者使用适合所有限制酶的通用缓冲液。或者使用适合所有限制酶的通用缓冲液。双酶切反应通用缓冲液使用表第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 酶切反应的终止酶切反应的终止 EDTA(终浓度终浓度10mmo

16、l/L)或或SDS 终浓度终浓度0.1%(W/V)；65温育温育20min；酚酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。氯仿抽提，乙醇沉淀。酶解结果鉴定酶解结果鉴定 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 限制酶与识别序列的结合模式限制酶与识别序列的结合模式GAATTCCTTAAG第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 完全消化完全消化：内切酶在：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。上的所有识别位点都被切开。局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。到局部消化的目的。

17、酶切的注意事项：酶切的注意事项：浓缩的限制酶可在使用前以浓缩的限制酶可在使用前以1限制酶缓冲液稀释。限制酶缓冲液稀释。购买的限制酶多保存于购买的限制酶多保存于50%甘油中，在甘油中，在-20是稳定的。进行是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回立即将酶放回-20冰箱。冰箱。尽量减少反应体积，但要

18、确保酶体积不超过反应总体积的尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。否则酶活性将受到甘油的抑制。通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。时可用。注意星号酶切活力。注意星号酶切活力。第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(一一)酶的纯度酶的纯度(二二)DNA样品的纯度样品的纯度 DNA样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等都有可能抑制酶活性。等都有可能抑制酶活性。可采用以下方法提高酶

19、活性：可采用以下方法提高酶活性：加大酶的用量，加大酶的用量，1g DNA用用10U酶酶加大反应总体积加大反应总体积延长反应时间延长反应时间添加阳离子亚精胺添加阳离子亚精胺 六、影响限制性内切核酸酶活性的因素六、影响限制性内切核酸酶活性的因素第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(三三)DNA样品的甲基化程度样品的甲基化程度E.coli中的中的dam甲基化酶在甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有位引入甲基，受其影响的酶有Bcl、Mbo等，但等，但BamH、Bgl、Sau3A不受影响。不受影响。E.coli中的中的dcm甲基化酶在甲基化酶在5CC

20、AGG3或或5CCTGG3序列中的胞嘧啶序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR等，但等，但Bgl、Kpn不受影响。不受影响。采用去甲基化酶或甲基化酶缺失的采用去甲基化酶或甲基化酶缺失的E.coli菌株来制备质粒菌株来制备质粒DNA，可防止，可防止DNA的甲基化。的甲基化。第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(四四)酶切反应的温度与时间酶切反应的温度与时间 大多数限制酶最适反应温度是大多数限制酶最适反应温度是37 酶解时间可通过加大酶量而缩短，反之酶量较少时，酶解时间可通过加大酶量而缩短，反之酶量较少时，可通过延长酶解时间以达到完全酶解可通过

21、延长酶解时间以达到完全酶解DNA的目的。的目的。(五五)DNA的分子构型的分子构型 某些酶切割超螺旋质粒某些酶切割超螺旋质粒DNA时，酶量比切割线性时，酶量比切割线性DNA时高出多倍，可高达时高出多倍，可高达20倍。倍。酶酶最适温度最适温度 酶酶最适温度最适温度 酶酶最适温度最适温度 ApaBclMaeTaq 30 50 50 65ApyBstEMae 30 60 55BanMaeSma 50 45 25第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(六六)限制酶的反应缓冲液限制酶的反应缓冲液 大多数限制酶所需的大多数限制酶所需的pH为为7.0-7.6。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品

22、化的限制酶一般都带有专用缓冲液。(七七)酶的星号活性酶的星号活性(star activity)限制酶的识别和切割特异性是在特定的条件下测定的，限制酶的识别和切割特异性是在特定的条件下测定的，当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。P19 例如当例如当EcoR在在pH8、盐离子浓度、盐离子浓度5%时，其识别序列由时，其识别序列由5GAATTC3变成变成5NAATTN3，特异性明显降低，以，特异性明显降低，以EcoR*表示表示这种活性。这种活性。第一节第一节

23、限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 导致星号活性发生的因素导致星号活性发生的因素高甘油含量高甘油含量(5%，V/V)；限制酶用量过大限制酶用量过大(100U/g DNA)；低离子强度低离子强度(pH8.0)；含有机溶剂含有机溶剂(如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等)；Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非等非Mg2+的二价阳离子存在。的二价阳离子存在。不同的限制酶出现的星号活性的阈值也不一样，常易不同的限制酶出现的星号活性的阈值也不一样，常易发生星号活性的酶有：发生星号活性的酶有：EcoR、Hind、Kpn、Pst、Sca、Sal、Hinf等。等。第一节第一

24、节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 抑制星号活性的方法抑制星号活性的方法尽量用较少的酶进行完全消化反应，这样可以尽量用较少的酶进行完全消化反应，这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度；避免过度消化以及过高的甘油浓度；尽量避免有机溶剂尽量避免有机溶剂(如制备如制备DNA时引入的乙醇时引入的乙醇)的污染的污染；将离子浓度提高到将离子浓度提高到100-150mM(若酶活性不受若酶活性不受离子强度影响离子强度影响)；将反应缓冲液的将反应缓冲液的pH值降到值降到7.0；二价离子用二价离子用Mg2+。第一节第一节 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 重组重组DNA前的切割前的切割 构建新质粒构建新质粒 构

25、建物理图谱构建物理图谱 DNA分子杂交分子杂交 用限制性内切酶消化受体用限制性内切酶消化受体DNA 制备制备DNA探针探针 亚克隆以用作序列分析亚克隆以用作序列分析 基因定位，基因定位，DNA同源性研究同源性研究七、限制性内切核酸酶的应用七、限制性内切核酸酶的应用第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶(DNA(DNA LigaseLigase)剪刀剪刀限制性内切酶限制性内切酶针线、胶水针线、胶水连接酶连接酶第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶 DNA连接酶是一种能够催化双链连接酶是一种能够催化双链DNA上彼此相邻的上彼此相邻的3-羟基羟

26、基(-OH)和和5-磷酸基团磷酸基团(-P)，在，在NAD+或或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。供能的作用下，形成磷酸二酯键。E.coli和其他细和其他细菌的菌的DNA连接酶以连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。作为能量来源。一、一、DNA连接酶连接酶的发现的发现第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶 是由是由T4噬菌体基因噬菌体基因30编码的多肽单体；编码的多肽单体；催化过程需要催化过程需要ATP供能；供能；可连接可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和和双链双链DNA的黏性末端或平末端。的

27、黏性末端或平末端。抑制剂：抑制剂：PO43-5mM，NaCl25mM，Ca2+0.1mM二、二、DNA连接酶连接酶的特点的特点1.T4 DNA连接酶连接酶P21第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶 是由是由E.coli基因基因lig编码的一条多肽链；编码的一条多肽链；可被胰蛋白酶水解；可被胰蛋白酶水解；催化过程需要催化过程需要NAD+供能；供能；能连接具黏性末端的能连接具黏性末端的DNA分子，也能连分子，也能连接双链接双链DNA的平末端，不能将的平末端，不能将DNA-RNA连接。连接。2.大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶P22第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶 从耐热菌中克隆到的从耐热

28、菌中克隆到的DNA连接酶基因可在连接酶基因可在E.coli中高水中高水平表达；平表达；以以NAD+为辅助因子，并优先作用于缺口；为辅助因子，并优先作用于缺口；若存在聚合剂，即使是高温，也能催化平末端的连接。若存在聚合剂，即使是高温，也能催化平末端的连接。3.热稳定热稳定DNA连接酶连接酶P22连接酶连接酶底物底物辅助辅助因子因子巯基巯基试剂试剂粘性末端粘性末端平末端平末端DNA-RNA杂合体杂合体RNA-RNA杂合体杂合体大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶可行可行可行可行不行不行不行不行NAD+Mg2+不需要不需要T4DNA连接酶连接酶可行可行可行可行可行可行可行可行ATPMg2+需需DTT噬

29、热菌噬热菌DNA连接酶连接酶可行可行不行不行不行不行不行不行NAD+Mg2+需要需要DNA连接酶的部分性质连接酶的部分性质第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶 DNA连接酶催化的连接反应特点连接酶催化的连接反应特点P22连接反应发生在一条连接反应发生在一条DNA链的链的3-OH端和另一端和另一条条DNA链的链的5-P端之间；端之间；连接反应需要连接反应需要ATP或或NAD+和和Mg2+作为辅助因子作为辅助因子与激活因子；与激活因子；DNA连接酶不能催化两单链连接酶不能催化两单链DNA分子或环化单分子或环化单链链DNA分子的连接；分子的连接；只能连接双链只能连接双链DNA分子的单链缺口分子的单

30、链缺口(nick)，不能，不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的裂口连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致的裂口(gap)。注意：缺口（或称切口）和裂口的区别！注意：缺口（或称切口）和裂口的区别！缺口缺口(nick)：即双链：即双链DNA分子的单链断裂，即在相邻的分子的单链断裂，即在相邻的2个核苷酸分子之间，失去了个核苷酸分子之间，失去了(移走了移走了)一个磷酸二酯键。一个磷酸二酯键。裂口裂口(gap)：即即DNA裂口，是指双链裂口，是指双链DNA分子上的某一条分子上的某一条链失去一个或数个核苷酸时所出现的链失去一个或数个核苷酸时所出现的DNA单链断裂。单链断裂。第二节第二节 DNADNA连接酶

31、连接酶DNA连接酶对不同连接酶对不同DNA分子的连接作用分子的连接作用第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶三、三、DNA连接酶连接酶的作用机理的作用机理P22第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶四、四、DNA连接酶的反应体系连接酶的反应体系 10T4 DNA Ligase Buffer 1L pKRX-T（30ng/L）1L 已纯化的已纯化的PCR产物产物 XL*T4 DNA Ligase 23Weiss Units ddH2O 至至10L五、影响连接反应的因素五、影响连接反应的因素反应温度：黏性末端一般为反应温度：黏性末端一般为4-15，平末端为，平

32、末端为10-20。连接酶浓度：平末端连接的最适酶量约为连接酶浓度：平末端连接的最适酶量约为1-2个个Weiss单位单位(P24)，而黏性末端在同样条件只要，而黏性末端在同样条件只要0.1个单位，连接时间为个单位，连接时间为16、4h或或4过夜。过夜。ATP浓度：最适终浓度一般为浓度：最适终浓度一般为0.5mmol/L。DNA片段末端：插入片段与载体的浓度比例为片段末端：插入片段与载体的浓度比例为10-20，增加插，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。第二节第二节 DNADNA连接酶连接酶分子间的不同连接产物分子内连接第三节第三节

33、 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶一、一、DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase)是指在引物和模板的存在下，将是指在引物和模板的存在下，将dNTP连续地加到双链连续地加到双链DNA分子分子引物链的引物链的3-OH末端，催化核苷酸聚合作用的酶。末端，催化核苷酸聚合作用的酶。P25 类型：依赖于类型：依赖于DNA的的DNA聚合酶和依赖于聚合酶和依赖于RNA的的DNA聚合酶。聚合酶。第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶DNA聚合酶聚合酶35外切酶外切酶活性活性53外切酶外切酶活性活性聚合速率聚合速率持续能力持续能力大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶低低有有

34、中中低低Klenow fragment低低无无中中低低T4 DNA聚合酶聚合酶高高无无中中低低T7 DNA聚合酶聚合酶高高无无快快高高化学修饰化学修饰T7DNA聚合酶聚合酶低低无无快快高高遗传修饰遗传修饰T7DNA聚合酶聚合酶无无无无快快高高逆转录酶逆转录酶无无无无低低中中Taq DNA聚合酶聚合酶无无有有快快高高 E.coli 3种类型的种类型的DNA聚合酶：聚合酶：DNA聚合酶聚合酶(DNA Pol)、DNA聚合酶聚合酶(DNA Pol)、DNA聚合酶聚合酶(DNA Pol)DNA聚合酶聚合酶是是A.Kornberg等于等于1956年首次在年首次在E.coli 中发现中发现的，它是由的，它

35、是由polA基因编码的一种单链多肽蛋白质。基因编码的一种单链多肽蛋白质。(一一)大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶P25-26第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶CCG 3GGCTATCGG 5E.coli DNApolIMg2+，dNTPCCGATAGCCGGCTATCGG1.53聚合酶活性聚合酶活性 GATAGCCAGCTATCGGTCGATAGCCAGCTATCGGE.coli DNApolIMg2+pC，pT5TCGATAGCCAGCTATE.coli DNApolIMg2+TCGATAAGCTAT+pC，pG，pC52.53外切酶活外切酶活性性 3.35外切酶活

36、外切酶活性性 DNA聚合酶聚合酶的三种活性的三种活性第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶 DNA聚合酶聚合酶的用途的用途补齐补齐5-突起端突起端合成第二条合成第二条cDNA除去除去3-端突起的单链端突起的单链DNA（在无（在无dNTP时）时）切口移位制备探针切口移位制备探针第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶 E.coli DNA聚合酶聚合酶被蛋白酶切割成两个大小不被蛋白酶切割成两个大小不同的片段，其中小片段具同的片段，其中小片段具53外切酶活性，外切酶活性，大片段具大片段具53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶外切酶活性，称为活性，称为E.coli

37、 DNA聚合酶聚合酶大片段或大片段或Klenow片段。片段。(二二)Klenow片段片段P27第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶 Klenow片段的主要用途片段的主要用途取代取代pol进行进行3端补平：补平经限制性内端补平：补平经限制性内切酶切后形成的切酶切后形成的3凹陷末端；凹陷末端；DNA 3末端标记：在末端标记：在3凹陷末端加上凹陷末端加上32P放射性标记的放射性标记的dNTP；双脱氧末端终止法进行双脱氧末端终止法进行DNA序列分析。序列分析。第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶5 klenow5 cDNA第二链的合成第二链的合成合成杂交探针

38、和进行体外突变：在单链模板上合成杂交探针和进行体外突变：在单链模板上延伸寡核苷酸引物。延伸寡核苷酸引物。第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶mRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow5 3 3 5 5 3 引物引物 具具53的的DNA聚合酶活性及很强的聚合酶活性及很强的35核酸外切酶活性（降解单链更快）。核酸外切酶活性（降解单链更快）。在无在无dNTP时，可以从任何时，可以从任何3-OH端外切端外切 在只有一种在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸时，外切至互补核苷酸 在四种在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位均存在时，聚合活性占主导地

39、位(三三)T4 DNA聚合酶聚合酶P27-28第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶 T4 DNA聚合酶的主要用途聚合酶的主要用途 补平或标记补平或标记DNA分子分子经限制性内切酶消化后形成的经限制性内切酶消化后形成的3凹凹端；端；对带有对带有3突出末端或平末端的突出末端或平末端的DNA片段进行标记，制备片段进行标记，制备特异性探针；特异性探针；利用利用T4 DNA聚合酶强的聚合酶强的3-5外切酶活性，将双链外切酶活性，将双链DNA 3突出末端转化为平末端。突出末端转化为平末端。第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶 从从T7噬菌体感染的噬菌体感染的E.

40、coli细胞中纯化出来的，由两个细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：亚基组成：T7基因基因5编码的大亚基：有编码的大亚基：有53聚聚合酶和合酶和35外切酶活性。外切酶活性。E.coli基因基因编码的小编码的小亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性。亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性。是所有已知是所有已知DNA聚合酶中持续结合能力最强的一个，聚合酶中持续结合能力最强的一个，主要用于催化大分子模板的引物延伸反应。主要用于催化大分子模板的引物延伸反应。测序酶：通过化学修饰或基因工程方法对测序酶：通过化学修饰或基因工程方法对T7 DNA聚聚合酶进行改造，去除其合酶进行改造，去除其35外切酶活

41、性，保留其外切酶活性，保留其聚合酶活性。聚合酶活性。(四四)T7 DNA聚合酶聚合酶P28第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶 来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。来源：从耐热细胞中纯化，已有基因工程酶多种。结构：单亚基，相对分子量为结构：单亚基，相对分子量为94 000。特点：热稳定性，特点：热稳定性，70反应反应2h残留活性为原来的残留活性为原来的90%；93反应反应2h残留活性为原来的残留活性为原来的60%；94反反应应2h残留活性为原来的残留活性为原来的40%。活性：聚合最适温度为活性：聚合最适温度为75-80，不具，不具35外切外切酶活性，具酶活性，具5

42、3 聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶外切酶活性。活性。用途：用途：PCR反应；测序，高温下进行反应；测序，高温下进行DNA合成可减合成可减少模板二级结构。少模板二级结构。(五五)Taq DNA聚合酶聚合酶P28第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶二、反转录酶二、反转录酶(reverse transcriptase)依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶(RNA指导的指导的DNA聚合酶聚合酶)来源：来源：来自禽类成髓细胞瘤病毒来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)(42,pH8.3)。来自来自Moloney鼠白血病毒鼠白血

43、病毒(M-MLV)(37,pH7.6)。结构和活性：结构和活性：酶类别酶类别 肽链肽链5-3聚合活性聚合活性RNAseHAMV64,00096,000 +M-MLV 71,000 +第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶 用途：用途：P29以以mRNA为模板合成其互补的为模板合成其互补的DNA(cDNA)，用于构，用于构建建cDNA和基因克隆；和基因克隆；对具对具5端突出的端突出的DNA片段的片段的3凹端进行补平和标记，凹端进行补平和标记，制备杂交探针；制备杂交探针；代替代替Klenow片段或测序酶，用于片段或测序酶，用于DNA序列分析。序列分析。cDNA合成的主要步骤：合

44、成的主要步骤：在某种生物的在某种生物的mRNA分子中，加入引物使之与分子中，加入引物使之与mRNA退火，并引导反转录酶按照退火，并引导反转录酶按照mRNA模板合成第一模板合成第一链链cDNA，产物是，产物是mRNA:DNA杂交分子；然后再以杂交分子；然后再以cDNA第一链为模板合成双链第一链为模板合成双链cDNA。第三节第三节 DNADNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶RNaseH活性活性第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶一、末端脱氧核苷酸转移酶一、末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)简称末端转移酶，能催化简称末端转移

45、酶，能催化53方向的聚合作方向的聚合作用，逐个地将用，逐个地将dNTP加到加到DNA分子的分子的3-OH末端。末端。特点：特点：不需要模板不需要模板无前体物特异性（无前体物特异性（同聚物加尾同聚物加尾）反应需要二价阳离子参与反应需要二价阳离子参与第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶3突出末端突出末端末端转移酶功能图解末端转移酶功能图解3凹陷末端凹陷末端第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶 用途：用途：P30用于克隆用于克隆DNA片段，给载体和外源片段，给载体和外源DNA 3末端分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者末端分别加上互补的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。在体外连接。用于用于DNA片段

46、片段3末端标记，末端标记，催化催化-32P-3-脱氧核苷酸标记脱氧核苷酸标记DNA片断的片断的3末端末端；催化生物素等非放射性的标记物掺入到催化生物素等非放射性的标记物掺入到DNA片断的片断的3-末端末端。按照模板合成多聚核糖核苷同聚物。按照模板合成多聚核糖核苷同聚物。第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶二、二、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)由由T4噬菌体的噬菌体的pseT基因编码，基因编码，能催化能催化-磷酸基从磷酸基从ATP转转移给单链或双链移给单链或双链DNA或或RNA的的5-OH端。端。P30 常用于两种反应：正向反应和交换反应。常用

47、于两种反应：正向反应和交换反应。用途：用途：DNA 5端磷酸化端磷酸化标记标记DNA或或RNA的的5端端5 3 3 5 3 HO-OHHO-OH3 P-OH5 HO-P5 pppATP(-32P的的ATP)T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶三、碱性磷酸酶三、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)能催化核酸分子脱掉能催化核酸分子脱掉5的磷酸基团从而使的磷酸基团从而使DNA或或RNA片段的片段的 5-P端转换成端转换成5-OH端。端。P31 来源和性质：来源和性质：来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶(BAP)，耐高温；，耐高温；

48、来自小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶来自小牛肠的小牛肠碱性磷酸酶(CIP)，70加热加热10min可完全失活。可完全失活。3 HO-P5 3 HO-OH5 3 HO-OH碱性磷酸酶碱性磷酸酶5 P-OH 3 5 第四节第四节 DNADNA修饰酶修饰酶 用途：用途：DNA或或RNA分子片段分子片段5末端的去磷酸化，防止末端的去磷酸化，防止自身连接；在自身连接；在5端标记之前，去除端标记之前，去除DNA或或RNA分子的分子的5末端磷酸基团。末端磷酸基团。P31-32其中每条链上都其中每条链上都有一个有一个nick，但，但转入细菌后会被转入细菌后会被修复。修复。第五节第五节 外切核酸酶外切核酸酶(Exonu

49、cleaseExonuclease)是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。类型：类型：P32作用于单链的外切核酸酶，如作用于单链的外切核酸酶，如E.coli外切核酸酶外切核酸酶(exo)、E.coli外切核酸酶外切核酸酶(exo)；作用于双链的外切核酸酶，作用于双链的外切核酸酶，E.coli外切核酸酶外切核酸酶(exo)、噬菌体外切核酸酶噬菌体外切核酸酶(exo)、T7噬菌体噬菌体基因基因6外切核酸酶；外切核酸酶；既可作用于单链又可作用于双链的外切核酸酶，如既可作用于单链又可作用于双链的外切核酸酶，如Bal 31核酸酶。核酸酶。第五节第

50、五节 外切核酸酶外切核酸酶底物底物核酸酶核酸酶外切起点外切起点识别位点识别位点切割产物切割产物单链单链DNAE.coli外切核酸酶外切核酸酶(exo)53 5-OH5-单核苷酸单核苷酸E.coli外切核酸酶外切核酸酶(exo)53355-P3-OH2-25bp寡核苷酸寡核苷酸片段片段双链双链DNAE.coli外切核酸酶外切核酸酶(exo)35 3-OH5-单核苷酸单核苷酸 噬菌体外切核酸酶噬菌体外切核酸酶(exo)53 5-P5-单核苷酸单核苷酸T7噬菌体基因噬菌体基因6外切核酸酶外切核酸酶535-P5-OH5-单核苷酸单核苷酸单、双单、双链链DNABal 31核酸酶：核酸酶：双链外切双链外切

51、、单链内切活性单链内切活性53353-OH5-单核苷酸，单核苷酸，缩短的缩短的dsDNA不同外切核酸酶的特性比较不同外切核酸酶的特性比较第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶 来源：来源于米曲霉菌，由来源：来源于米曲霉菌，由nucO编码，已被克隆。编码，已被克隆。功能：功能：是一种高度特异的单链内切核酸酶，需要是一种高度特异的单链内切核酸酶，需要Zn2+、高离子强度和酸性条件；高离子强度和酸性条件；降解降解ssDNA的速度比降解的速度比降解ssRNA快快7倍。倍。一、一、S1核酸酶核酸酶P34第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶 注意：注意：S1核酸酶酶量过大时，伴有双链核酸的降解，

52、但核酸酶酶量过大时，伴有双链核酸的降解，但降解速度仅为单链的降解速度仅为单链的1/75 000。第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶 用途：用途：切掉切掉DNA片段的单链突出末端；片段的单链突出末端；在双链在双链cDNA合成中切除发夹环结构；合成中切除发夹环结构；第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶 S1核酸酶作图法确定真核基因中内含子的位置、核酸酶作图法确定真核基因中内含子的位置、RNA分分子定位等。子定位等。第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶 对单链对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从具有特异的内切酶活性，可从3-OH末末端迅速降解端迅速降解DNA；对线性对线性dsD

53、NA，具有，具有35外切酶活性和外切酶活性和53外切酶活性，产生外切酶活性，产生5-单核苷酸和缩短的单核苷酸和缩短的dsDNA；外切酶活性远远大于内切酶活性。外切酶活性远远大于内切酶活性。二、二、Bal 31核酸酶核酸酶P34-35第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶 用途用途：绘制限制酶谱，：绘制限制酶谱，DNA定序，构建缺失突变体等。定序，构建缺失突变体等。第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶 简称简称DNA酶酶(DNase)，是来源于牛胰脏的糖蛋白；，是来源于牛胰脏的糖蛋白；能从嘧啶核苷酸能从嘧啶核苷酸5磷酸基处随机降解磷酸基处随机降解ss或或dsDNA，生，生成具有成具有5

54、-P末端的寡核苷酸，反应需要二价阳离子。末端的寡核苷酸，反应需要二价阳离子。用途：用途：与与E.coli DNA聚合酶聚合酶一起参与切口平移；一起参与切口平移；构建基因组文库；构建基因组文库；用于用于DNase足迹法分析足迹法分析DNA结合蛋白在结合蛋白在DNA上的上的精确结合位点；精确结合位点；去除转录产物中的模板去除转录产物中的模板DNA；去除去除RNA制备中的制备中的DNA。三、脱氧核糖核酸酶三、脱氧核糖核酸酶P35-36第七节第七节 RNARNA酶酶 是来源于牛胰脏的内切核酸酶；可特异地切割是来源于牛胰脏的内切核酸酶；可特异地切割RNA上嘧啶残基上嘧啶残基3端与相邻核苷酸形成的磷酸二酯

55、键，端与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，生成嘧啶生成嘧啶3磷酸和末端带嘧啶磷酸和末端带嘧啶3磷酸的寡核苷酸。磷酸的寡核苷酸。无辅因子及二价阳离子时，无辅因子及二价阳离子时，RNA酶酶A 的活性可被的活性可被RNasin或氧钒核糖核苷复合物所抑制。或氧钒核糖核苷复合物所抑制。反应条件极宽，极难失活。反应条件极宽，极难失活。用途：用途：从从DNA:RNA或或RNA:RNA杂合体中去除未杂合的杂合体中去除未杂合的RNA区；区；降解降解DNA制备物中的制备物中的RNA分子；分子；确定确定DNA或或RNA中单碱基突变的位置；中单碱基突变的位置；RNA检测。检测。一、核糖核酸酶一、核糖核酸酶A(RNA酶酶A,

56、RNase A)P36第七节第七节 RNARNA酶酶 广泛存在于哺乳动物细胞、酵母、原核生物及病毒广泛存在于哺乳动物细胞、酵母、原核生物及病毒颗粒中，最早是从小牛胸腺中发现的，编码的基因颗粒中，最早是从小牛胸腺中发现的，编码的基因已被克隆并在已被克隆并在E.coli中表达。中表达。能特异地内切降解能特异地内切降解DNA:RNA杂合链中的杂合链中的RNA部分，部分，产生不同长度的具有产生不同长度的具有3-OH和和5-P末端的寡核苷酸末端的寡核苷酸 用途：用途：与与E.coli DNA聚合酶聚合酶和和DNA连接酶一起参与连接酶一起参与cDNA克隆中第二条克隆中第二条cDNA互补链的合成；互补链的合

57、成；用于通过反义寡聚用于通过反义寡聚DNA与与RNA产生局部的双链体，产生局部的双链体，诱发特异性的诱发特异性的RNA降解，有效调控特定基因的表降解，有效调控特定基因的表达。达。二、核糖核酸酶二、核糖核酸酶H(RNase H)P36第七节第七节 RNARNA酶酶 是从米曲霉中分离纯化的内切核酸酶。是从米曲霉中分离纯化的内切核酸酶。能特异地切割鸟嘌呤能特异地切割鸟嘌呤3磷酸与相邻核苷酸的磷酸与相邻核苷酸的5-OH之间的磷酸二酯键，生成之间的磷酸二酯键，生成3鸟苷酸及末端带鸟苷酸及末端带3鸟苷酸的寡核苷酸片段。鸟苷酸的寡核苷酸片段。反应条件极宽，极难失活，其活性类似反应条件极宽，极难失活，其活性类

58、似RNase A。用途：用途：在核糖核酸酶保护实验中，与在核糖核酸酶保护实验中，与RNase A联合使联合使用，对用，对RNA进行定量和作图；进行定量和作图；去除去除DNA-RNA杂交体中未杂交的杂交体中未杂交的RNA区域。区域。三、核糖核酸酶三、核糖核酸酶T1(RNase T1)P36-37核酶（补充）核酶（补充）具有酶活性的具有酶活性的RNA片段。片段。是真核生物转录产物的内是真核生物转录产物的内含子本身含有的前导序列，含子本身含有的前导序列，能在离体条件下特异地催能在离体条件下特异地催化内含子剪切。化内含子剪切。1981 Cech和和Altman首次发首次发现，并因此获得现，并因此获得1

59、989年的年的诺贝尔奖。诺贝尔奖。核酶可以作为核酶可以作为RNA的限制的限制性内切酶用于基因操作。性内切酶用于基因操作。核酶（核酶（ribozyme）甲基化酶（补充）甲基化酶（补充）dam甲基化酶在甲基化酶在 5GATC3 的的腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入位置引入甲基，有些限制酶对甲基，有些限制酶对dam甲基化敏感，有些不敏感。甲基化敏感，有些不敏感。dcm甲基化酶在甲基化酶在5CCAGG3或或5CCTGG3序序列第二个列第二个C的的C5位置上引入甲基，有些酶受影响，位置上引入甲基，有些酶受影响，有些酶不受影响。有些酶不受影响。用途：用途：改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体改变某些限制酶识

60、别顺序的特异性，以便重组体的形成；的形成；在建立基因文库时，可先使在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，分子部分甲基化，然后再用限制酶切。然后再用限制酶切。小结小结本章重点掌握的内容本章重点掌握的内容本章重点掌握的内容本章重点掌握的内容:限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、限制性核酸内切限制性核酸内切酶、同裂酶、同尾酶、限制性核酸内切酶星号活性、宿主的限制与修饰、酶星号活性、宿主的限制与修饰、1个单位限制性核酸内个单位限制性核酸内切酶的概念。切酶的概念。型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生型限制性核酸内切酶命名原则、操作注意事项及产生星号活性的原因、影响其酶活性的因素。星号活性的原因、影响其酶活性的因素。DNA聚合酶的种类及性质聚合酶的种类及性质 T4 DNA连接酶作用机制。连接酶作用机制。其它常用工具酶的功能及其用途。其它常用工具酶的功能及其用途。作业：作业：课后习题课后习题