DNA的溶解度问题

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1、5+乙醇沉淀法是一种常用的技术集中的盐在水溶液中的核酸（DNA或RNA）准备。 其基本做法是，加入盐和乙醇水溶液，这迫使核酸沉淀出的解决方案。然后可 以休息的解决方案，通过离心分离沉淀核酸。在寒冷的70%乙醇洗涤沉淀， 然后再经过离心步骤乙醇被删除，并允许核酸颗粒干燥，然后在干净的缓冲溶 液中悬浮。那么如何工作的呢？关于溶解度的位首先，我们需要知道为什么核酸是易溶于水。水是极性分子-它有一个部分负电荷的氧原 子附近，由于共用电子对，部分正电荷的氢原子（见右图）附近。极性分子，如DNA或RNA，因为这些费用，可以与水分子的静电相互作用，使他们能够很 容易溶解于水。极性分子，因此可以被描述为亲水性

2、和非极性分子，不能轻易与水分子相 互作用，疏水。核酸是亲水性由于带负电荷的磷（PO3-）组沿糖磷酸骨架。盐的作用好吧，这样的协议。盐在协议中的作用是消除糖磷酸骨架上的收费。一种常用的盐是醋酸 钠。在溶液中，分解成Na +和醋酸-醋酸钠。带正电的钠离子中和负电荷的核酸PO3 组，分子远低于亲水性，因此多不溶于水。乙醇的作用钠离子在溶液中和PO3-离子之间的静电吸引力，库仑定律，这是解决方案的电介质常数 的影响决定。水具有较高的介电常数，这使得它相当困难Na +和 PO3-走到一起。另一方 面乙醇低得多的介电常数，使得它的Na +更容易互动，PO3-，它的电荷屏蔽，使核酸的亲 水性，使其下降了解决

3、方案。温度的作用作为必要的协议，在协议中普遍提及的核酸/盐/乙醇的混合物在低温（如-20或-80C）的孵 化。然而，根据，曼尼阿蒂斯等（分子克隆实验手册第二版第二版-?!我需要得到一 个新的版本），这是不是必需的，因为20ng/mL低浓度核酸沉淀在0-4C，所以在冰上潜伏 期为15-30分钟就足够了。用70%乙醇洗涤步骤.这一步是洗任何剩余的盐颗粒的DNA。核酸沉淀的一些技巧盐的选择 使用常规的DNA沉淀醋酸钠（0.3M终浓度，pH值5.2） 使用DNA含有SDS自氯化钠保持SDS在70%乙醇中易溶，所以它不会沉 淀的DNA样本，氯化钠（0,2米决赛浓度）。 使用氯化锂（0.8M终浓度）的RN

4、A。这是因为2.5-3乙醇卷应该被用于 RNA沉淀和LiCI是比乙酸钠溶于乙醇，所以不会沉淀，但要小心-氯离子会 抑制蛋白质的合成和DNA聚合酶，使氯化锂的RNA PREPS没有好的在体外 翻译或反转录。在这种情况下，使用醋酸钠。 用于去除dNTPs浓度的醋酸铵（2M终浓度），但不使用T4聚核苷酸激 酶反应制备的DNA鞍离子抑制酶。在低浓度或小核酸件（少于100个核苷酸）的降水以增加产量 氯化镁的终浓度为0.01M 潜伏期冰离心前的时间增加至1小时。酚/氯仿抽提和乙醇沉淀描述酚/氯仿抽提最常用的和有益的，从水溶液中的 DNA 和 RNA 的分离和浓度的方法 之一是酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。 在有

5、机萃取，蛋白质污染物变性 和分区与有机相或有机相和水相之间的界面，而留在水相中的核 酸。在这个协议中使用的苯酚缓冲，以防止破坏核酸在苯酚氧化 的产品。要知道，酚可引起严重的化学烧伤，皮肤上，会损伤衣 物。与苯酚工作时戴手套，安全眼镜，实验室大衣。建议在这里 提出的方法，酚/氯仿（50%/ 50%V / V）提取。在大多数情 况下，这种混合物提供良好的蛋白质变性和水相和有机相之间的更紧密 相间。 提取过程中过多的泡沫如果有一个问题，异戊醇可以增加获得的酚 / 氯仿（50%/ 49%）/异戊醇（%）的有机组成。传统的乙醇沉淀在乙醇沉淀，盐和其他溶质，如残余苯酚和氯仿溶液中保持，而核 酸形成白色沉淀

6、物，可以很容易地通过离心收集。 如果水的体积 小于450 PL，反应可在离心管中。这是最方便的格式进行有机提 取物和乙醇沉淀。 对于体积较大，可以使用多种离心管，可以扩 展或反应。 当缩放的反应了，使用的酚/氯仿提取，并离心机盖紧 聚丙烯管在 2500 在室温下转速来解决阶段聚苯乙烯管能不能承受 的酚/氯仿乙醇沉淀可以将在15个执行-。或30 -毫升的Corex 管，沉淀15分钟，在4C离心收集10,000 XG。据建议，Corex 公司管是使用在 50%硝酸浸泡在蒸馏水彻底清洗，高压灭菌20 分钟， 1 小时前洗酸。在我们的手，核酸片段和寡核苷酸超过 15 个核苷酸可以有效地沉 淀，使用此协

7、议。 为了有效降水，核酸浓度应该是至少 10 GG / 毫升。 可以沉淀核酸的浓度较低，但经济复苏可能不定量。 沉淀 核酸浓度较低，在-20“C”（或干冰）孵育4小时至过夜，离心 30分钟，收集沉淀的沉淀。 另外，可以有效地沉淀核酸纳克数量 加入酵母 tRNA 载波解决方案前发起的提取和降水过程，获得了10 克/毫升的核酸浓度。 tRNA 的载体的存在通常是没有问题的，除 承运人时，会干扰随后的酶样品的操作（例如，如果将DNA片段， 用 T4 多核苷酸激酶末端标记）。这种方法最常规应用的建议盐0.3M醋酸钠（终浓度），这是更大 于0.3 m氯化钠溶于乙醇，因此不太可能与核酸样品沉淀。对于 含有

8、十二烷基硫酸钠（SDS）的样品，建议的盐是氯化钠0.2 mol 以来，SDS是在这些条件下易溶于乙醇。2 M醋酸铵为三磷酸去 除（或其他标记），而不是建议的0.3 M醋酸钠，因为三磷酸沉淀 在这些情况下是不太可能的。 醋酸铵不建议，如果核酸样品将在 5 末端转移的磷酸化， T4 激酶或在 3 尾“，因为残留的铵离子会抑 制这两种酶。 另外，氯化锂可以用作盐沉淀。 相反，另外 1/10 体积3 M醋酸钠，加1/10体积8米氯化锂。由于氯化锂是非常易 溶于乙醇，由此产生的沉淀物是相对无盐。 应避免使用氯化锂， 然而，如果沉淀RNA将沉淀后的逆转录的模板。降水过程的变化如果是可取保持沉淀核酸量到最低

9、限度，在水溶液中的DNA溶液的 体积等于体积的异丙醇，可以代替乙醇沉淀反应。 这种替代，降 水可以从700 LIL 开始在一个单一的离心管中的水体积。 异丙醇 是不是如乙醇挥发，因此更难以去除在真空离心蒸发。 一些盐不 溶于异丙醇中，并可能与核酸的沉淀。 据建议，随后立即由一个 传统的乙醇沉淀，消除残留的异丙醇和盐，异丙醇沉淀。基因组DNA提取由于庞大的规模和脆弱性染色体DNA，这是不可能的，任何人都曾经是孤立的， 它在一个完整的，没有损坏的形式。几个隔离程序已开发提供DNA生物活性的 形式，但这并不意味着它是完全没有损坏。这些DNA的筹备工作稳定，超高分 子量和相对自由的RNA和蛋白质。在这

10、里，一般的方法将在一个稳定的，具有 生物活性的形式，从微生物的DNA提取。所述的程序是适用于许多微生物，并 可以根据需要进行修改。设计DNA分离过程，需要广泛的知识蜂窝环境中的化学稳定性的DNA以及它的条 件。 在提取过程中，几种化学债券可能受到切割。 实验必须考虑的因素和各种 完整的 DNA 结构方面的影响概述如下。1 。 pH 值（一）氢之间的互补链结合是稳定的pH值为4和10之间。（二）在DNA骨架的磷酸二酯的联系是稳定的pH值3和 12之间。（三）的N-糖苷债券嘌吟碱基（腺嘌吟和鸟嘌吟）水解的 pH 值和小于 3。2 。 温度（一）有相当大的变化，在温度稳定的双螺旋结构中的氢 键，但大

11、多数的 DNA 将开始放松范围在 80-90C。b.磷酸的联系和稳定的N-糖苷键的高达IOOOC。3。离子强度（一）DNA是最稳定和可溶性盐溶液中。盐浓度小于0.1 米削弱互补链之间的氢键。4。细胞条件（一）之前可以释放的DNA，细菌的细胞壁，必须裂解。与细胞 壁被破坏的易用性，不同机体有机体。 在某些情况下（酵母）， 需要广泛的研磨或超声波治疗，而在其他（枯草杆菌）， 细胞壁水 解酶是可能的。（二）一些酶可能采取行动，降解DNA的细胞中存在，但由 deoxyribonucleases 造成的损害最为严重。 这些酶催化水解磷酸 联系。（三）原住民的DNA是细胞DNA-蛋白质复合物。在提取过程中

12、, 必须是分离的蛋白质（蛋白质称为组蛋白的基本）。5。机械应力的 DNA（一）温和的操作可能并不总是可能的隔离过程中。 磨， 震动，搅拌，和其他破坏性程序，可能会导致的 DNA 链的断 裂（剪切或断裂）。 这通常不会造成损害的 DNA 的二级结构，但 它确实降低分子的长度。现在，这些因素是可以理解的，DNA提取的一般程序可概括：第1步。中断介质，它是降解可溶性和保护细胞膜和DNA的释放 这里所描述的隔离程序要求使用的一种酶，溶菌酶，破坏细胞膜。 溶菌酶催化 细胞壁碳水化合物糖苷键的水解，从而造成破坏 DNA 和其他细胞成分的外膜和释 放。DNA溶液的介质是一个缓冲，含EDTA的盐溶液。的DNA

13、,因为它是离子， 是更多的可溶性盐溶液中的稳定比蒸馏水。EDTA的服务至少有两个目的。首 先，它结合二价金属离子（镉“，镁，锰2+），可能形成的DNA的阴离子磷酸 盐组盐。其次，它抑制deoxyribonucleases要求为镁+或锰21。柠檬酸有偶尔被用 作螯合剂DNA提取的，但它是不弱碱性介质中（pH值8）有效结合锰2“的代理行为，以减少DNA 的基本组蛋白和阳离子胺，精胺之间的静电相互作用。和亚精胺（见实验 21）。相对较高的 pH 值也趋于减少核酸酶的活性和变性其他蛋白质。第2步。蛋白质-DNA复合物的解离在这个阶段用于洗涤剂，扰乱离子带正电荷的组蛋白和带负电荷的DNA骨干之间 的相互

14、作用。十二烷基硫酸钠（SDS），阴离子洗涤剂，蛋白质结合，并为他们 提供了广泛的阴离子字符。 二次行动的 SDS 是作为一个 deoxyribonucleases 和其他蛋白质的变性。也有利于蛋白质-DNA复合物的分离，是碱性的pH值， 从而降低了组蛋白的正面人物。补充，以确保完整的DNA-蛋白质复合体分离和 删除绑定阳离子胺，高浓度的盐（氯化钠或氯酸钠）。盐的行为，减少DNA和 阳离子之间的离子相互作用。第 3 步。 其他可溶性细胞成分 DNA 的分离DNA沉淀之前，解决方案必须脱蛋白。这是所带来的氯仿/异戊醇治疗和离心。 离心后，生产三个层次：上层水相，有机层较低，紧凑乐队的变性蛋白在水相

15、和有机相之间的界面。 氯 仿导致表面的蛋白质变性。 异戊醇降低发泡和稳定之间的水相和有机相蛋白收 集的接口。上层水相，含核酸分离和DNA加入乙醇沉淀。因为离子性质的DNA，它成为不 溶性如果在aqeuous的介质是由另外一种有机溶剂的极性较低。DNA形成丝状 沉淀，可以通过“假脱机”到玻璃棒收集。仍可能受到污染的孤立的DNA与蛋 白质和RNA。可去除蛋白质溶解在盐水介质的假脱机的DNA重复氯仿/异戊醇治 疗，直到没有更多的变性蛋白在接口收集。RNA不正常沉淀的DNA 一样，但它仍然是轻微污染。RNA可能是治疗用核糖核 酸酶降解后的第一或第二的脱蛋白的步骤，在手术过程中。另外，DNA可与异 丙醇

16、，这使溶液中的RNA沉淀。有时去除的RNA可以使变性的蛋白，用氯仿/ 异戊醇。如果需要高纯度的状态中的DNA，进行了几种脱蛋白，乙醇沉淀步骤 可。据估计，多达50%的细胞DNA被隔离。平均收益率是1至2毫克每克湿 细胞排列。DNA 的表征 在紫外线范围，因为存在的芳香基地，腺嘌吟，鸟嘌吟，胞嘧啶和胸腺嘧啶，DNA 有显着的吸收。这提供了一个有用的探针DNA的结构，因为如螺旋结构的变化, 平仓影响吸收的程度。此外，吸收测量被用来作为DNA纯度的迹象。纯化DNA 在约260 nm峰的主要吸收带。蛋白原料，在DNA的主要污染物，有一个在280 nm处的吸收峰。比A260/A280的 经常被用来作为一

17、个DNA样本的核酸/蛋白质含量相对措施。 典型 的 A260/A280 孤立的 DNA 是1.9。 一个较小的比例，表明增加蛋白质的污染。&酚/氯仿抽提和乙醇沉淀描述酚/氯仿抽提最常用的和有益的，从水溶液中的DNA和RNA的分离和浓度的方法 之一是酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。 在有机萃取，蛋白质污染物变性 和分区与有机相或有机相和水相之间的界面，而留在水相中的核 酸。在这个协议中使用的苯酚缓冲，以防止破坏核酸在苯酚氧化 的产品。要知道，酚可引起严重的化学烧伤，皮肤上，会损伤衣 物。与苯酚工作时戴手套，安全眼镜，实验室大衣。建议在这里 提出的方法，酚/氯仿（50%/ 50%V / V）提取。在大多数

18、情 况下，这种混合物提供良好的蛋白质变性和水相和有机相之间的更紧密 相间。 提取过程中过多的泡沫如果有一个问题，异戊醇可以增加获得的酚 / 氯仿（50%/ 49%）/异戊醇（%）的有机组成。传统的乙醇沉淀在乙醇沉淀，盐和其他溶质，如残余苯酚和氯仿溶液中保持，而核 酸形成白色沉淀物，可以很容易地通过离心收集。 如果水的体积 小于450 PL，反应可在离心管中。这是最方便的格式进行有机提 取物和乙醇沉淀。 对于体积较大，可以使用多种离心管，可以扩 展或反应。 当缩放的反应了，使用的酚/氯仿提取，并离心机盖紧 聚丙烯管在 2500 在室温下转速来解决阶段聚苯乙烯管能不能承受 的酚/氯仿乙醇沉淀可以将

19、在15个执行-。或30 -毫升的Corex 管，沉淀15分钟，在4C离心收集10,000 XG。据建议，Corex 公司管是使用在 50%硝酸浸泡在蒸馏水彻底清洗，高压灭菌20 分钟， 1 小时前洗酸。在我们的手，核酸片段和寡核苷酸超过15个核苷酸可以有效地沉 淀，使用此协议。 为了有效降水，核酸浓度应该是至少 10 GG / 毫升。 可以沉淀核酸的浓度较低，但经济复苏可能不定量。 沉淀 核酸浓度较低，在-20“C”（或干冰）孵育4小时至过夜，离心 30 分钟，收集沉淀的沉淀。 另外，可以有效地沉淀核酸纳克数量 加入酵母tRNA载波解决方案前发起的提取和降水过程，获得了 10 克/毫升的核酸浓

20、度。 tRNA 的载体的存在通常是没有问题的，除 承运人时，会干扰随后的酶样品的操作（例如，如果将DNA片段， 用 T4 多核苷酸激酶末端标记）。这种方法最常规应用的建议盐0.3M醋酸钠（终浓度），这是更大 于0.3 m氯化钠溶于乙醇，因此不太可能与核酸样品沉淀。对于 含有十二烷基硫酸钠（SDS）的样品，建议的盐是氯化钠0.2 mol 以来，SDS是在这些条件下易溶于乙醇。2 M醋酸铵为三磷酸去 除（或其他标记），而不是建议的0.3 M醋酸钠，因为三磷酸沉淀 在这些情况下是不太可能的。 醋酸铵不建议，如果核酸样品将在 5末端转移的磷酸化，T4激酶或在3尾“，因为残留的铵离子会抑 制这两种酶。

21、另外，氯化锂可以用作盐沉淀。 相反，另外 1/10 体积3 M醋酸钠，加1/10体积8米氯化锂。由于氯化锂是非常易 溶于乙醇，由此产生的沉淀物是相对无盐。 应避免使用氯化锂， 然而，如果沉淀RNA将沉淀后的逆转录的模板。降水过程的变化如果是可取保持沉淀核酸量到最低限度，在水溶液中的DNA溶液的 体积等于体积的异丙醇，可以代替乙醇沉淀反应。 这种替代，降 水可以从700 LIL 开始在一个单一的离心管中的水体积。 异丙醇 是不是如乙醇挥发，因此更难以去除在真空离心蒸发。 一些盐不 溶于异丙醇中，并可能与核酸的沉淀。 据建议，随后立即由一个 传统的乙醇沉淀，消除残留的异丙醇和盐，异丙醇沉淀。基因组

22、DNA提取由于庞大的规模和脆弱性染色体DNA，这是不可能的，任何人都曾经是孤立的， 它在一个完整的，没有损坏的形式。几个隔离程序已开发提供DNA生物活性的 形式，但这并不意味着它是完全没有损坏。这些DNA的筹备工作稳定，超高分 子量和相对自由的RNA和蛋白质。在这里，一般的方法将在一个稳定的，具有 生物活性的形式，从微生物的DNA提取。所述的程序是适用于许多微生物，并 可以根据需要进行修改。设计DNA分离过程，需要广泛的知识蜂窝环境中的化学稳定性的DNA以及它的条 件。 在提取过程中，几种化学债券可能受到切割。 实验必须考虑的因素和各种 完整的 DNA 结构方面的影响概述如下。1 。 pH 值

23、（一）氢之间的互补链结合是稳定的pH值为4和10之间。（二）在DNA骨架的磷酸二酯的联系是稳定的pH值3和 12之间。（三）的N-糖苷债券嘌吟碱基（腺嘌吟和鸟嘌吟）水解的 pH 值和小于 3。2 。 温度（一）有相当大的变化，在温度稳定的双螺旋结构中的氢 键，但大多数的 DNA 将开始放松范围在 80-90C。b.磷酸的联系和稳定的N-糖苷键的高达IOOOC。3 。 离子强度（一） DNA 是最稳定和可溶性盐溶液中。 盐浓度小于 0.1 米削弱互补链之间的氢键。4 。 细胞条件（一）之前可以释放的DNA，细菌的细胞壁，必须裂解。与细胞 壁被破坏的易用性，不同机体有机体。 在某些情况下（酵母），

24、 需要广泛的研磨或超声波治疗，而在其他（枯草杆菌）， 细胞壁水 解酶是可能的。（二）一些酶可能采取行动，降解 DNA 的细胞中存在，但由 deoxyribonucleases 造成的损害最为严重。 这些酶催化水解磷酸 联系。（三）原住民的DNA是细胞DNA-蛋白质复合物。在提取过程中, 必须是分离的蛋白质（蛋白质称为组蛋白的基本）。5。 机械应力的 DNA（一）温和的操作可能并不总是可能的隔离过程中。 磨， 震动，搅拌，和其他破坏性程序，可能会导致的 DNA 链的断 裂（剪切或断裂）。 这通常不会造成损害的 DNA 的二级结构，但 它确实降低分子的长度。现在，这些因素是可以理解的， DNA 提

25、取的一般程序可概括：第 1 步。 中断介质，它是降解可溶性和保护细胞膜和 DNA 的释放这里所描述的隔离程序要求使用的一种酶，溶菌酶，破坏细胞膜。 溶菌酶催化 细胞壁碳水化合物糖苷键的水解，从而造成破坏 DNA 和其他细胞成分的外膜和释 放。DNA溶液的介质是一个缓冲，含EDTA的盐溶液。的DNA，因为它是离子, 是更多的可溶性盐溶液中的稳定比蒸馏水。 EDTA 的服务至少有两个目的。 首 先，它结合二价金属离子（镉“，镁，锰 2+），可能形成的 DNA 的阴离子磷酸 盐组盐。其次，它抑制deoxyribonucleases要求为镁+或锰21o柠檬酸有偶尔被用作螯合剂DNA提取的，但它是不弱碱

26、性介质中（pH值8）有效结合锰2“的代理行为，以减少DNA 的基本组蛋白和阳离子胺，精胺之间的静电相互作用。和亚精胺（见实验 21） 。相对较高的 pH 值也趋于减少核酸酶的活性和变性其他蛋白质。第 2 步。 蛋白质 -DNA 复合物的解离在这个阶段用于洗涤剂，扰乱离子带正电荷的组蛋白和带负电荷的DNA骨干之间 的相互作用。十二烷基硫酸钠（SDS），阴离子洗涤剂，蛋白质结合，并为他们 提供了广泛的阴离子字符。 二次行动的 SDS 是作为一个 deoxyribonucleases 和其他蛋白质的变性。也有利于蛋白质-DNA复合物的分离，是碱性的pH值， 从而降低了组蛋白的正面人物。补充，以确保完

27、整的DNA-蛋白质复合体分离和 删除绑定阳离子胺，高浓度的盐（氯化钠或氯酸钠）。盐的行为，减少DNA和 阳离子之间的离子相互作用。第 3 步。 其他可溶性细胞成分 DNA 的分离DNA沉淀之前，解决方案必须脱蛋白。这是所带来的氯仿/异戊醇治疗和离心。 离心后，生产三个层次：上层水相，有机层较低，紧凑乐队的变性蛋白在水相和有机相之间的界面。 氯 仿导致表面的蛋白质变性。 异戊醇降低发泡和稳定之间的水相和有机相蛋白收 集的接口。上层水相，含核酸分离和DNA加入乙醇沉淀。因为离子性质的DNA，它成为不 溶性如果在aqeuous的介质是由另外一种有机溶剂的极性较低。DNA形成丝状 沉淀，可以通过“假脱

28、机”到玻璃棒收集。仍可能受到污染的孤立的DNA与蛋 白质和RNA。可去除蛋白质溶解在盐水介质的假脱机的DNA重复氯仿/异戊醇治 疗，直到没有更多的变性蛋白在接口收集。RNA不正常沉淀的DNA 一样，但它仍然是轻微污染。RNA可能是治疗用核糖核 酸酶降解后的第一或第二的脱蛋白的步骤，在手术过程中。另外，DNA可与异 丙醇，这使溶液中的RNA沉淀。有时去除的RNA可以使变性的蛋白，用氯仿/ 异戊醇。如果需要高纯度的状态中的DNA，进行了几种脱蛋白，乙醇沉淀步骤 可。据估计，多达50%的细胞DNA被隔离。平均收益率是1至2毫克每克湿 细胞排列。DNA 的表征在紫外线范围，因为存在的芳香基地，腺嘌呤，

29、鸟嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶， DNA 有显着的吸收。这提供了一个有用的探针DNA的结构，因为如螺旋结构的变化， 平仓影响吸收的程度。此外，吸收测量被用来作为DNA纯度的迹象。纯化DNA 在约260 nm峰的主要吸收带。蛋白原料，在DNA的主要污染物，有一个在280 nm处的吸收峰。比A260/A280的 经常被用来作为一个DNA样本的核酸/蛋白质含量相对措施。 典型的A260/A280孤立的DNA是1.9。 一个较小的比例，表明增加蛋白质的污染。英语原文:Phenol used in this protocol is buffered to prevent oxidized products in the phe nol from damag ing the nu cleic acids.+更好的翻译建议英语原文:Phenol used in this protocol is buffered to prevent oxidized products in the phe nol from damag ing the nu cleic acids.+更好的翻译建议