生物技术药物发展

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1、、生物技术药物发展前景：1) 医药工业“十二五”发展规划生物技术药物已被列为五大核心发展目标之一。全球生物技术药物将进入大规模产业化阶段2) 未来5年，全球药品销售保持3-6%增速，2015年达1.1万亿$，生物技术药物销售收入有望连续保持15%增速，是全部药品销售收入增速的2倍以上3) 预计2015年，中国生物医药市场有望达到1000亿美元4) 在2010年世界前20位的畅销药物中，生物技术药物占到7种5) 预计2020年，全球生物技术药物将占全部药品销售收入比重的1/3以上6) 美、欧、日等发达国家市场虽然仍居全球药品销售主导地位，但市场增速将放缓至1-4%7) 中国、印度、巴西、俄罗斯等

2、十余个新兴医药市场将以14-17%的速度增长。为生物技术药物和生产企业打开广阔市场空间2、利用基因工程技术生产药品的优点：1) 可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障2) 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围3) 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质4) 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。5) 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源3、逆（反）转录法：1) 定义：以目的基因转录成的m

3、RNA为模板，反转录成互补的单链DNA（cDNA），然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获取所需的基因。2) 过程：以RNA为模板，由dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)聚合成DNA分子。此过程RNADNA与核酸合成和转录DNARNA相反，故称为逆转录。3) 优点：专一性强，cDNA与模板mRNA严格互补，不含内含子，可合成自然界不存在的新基因。4) 缺点：操作复杂，形成的mRNA为单链，生存时间短，不稳定，要求的技术条件较高。5) 步骤: mRNA纯化 cDNA第一链合成 cDNA第二链合成 cDNA克隆将重组体导入宿主细胞 cDNA文库的鉴定目的cDNA克隆的分离与鉴定4、p

4、BV220系统：1) 组成:来源于pUC8多克隆位点核糖体rrnB基因终止信号pBR322第42253735位pUC18第2066680位噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子pRC23的PL启动子及SD序列2) 优点：可使表达产物不易降解可表达非融合蛋白利于质粒-宿主系统的稳定可插入大片段外源基因可增强启动作用3) 适宜性：本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、JM103、C600，质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%30%5、乙酸控制1) 控制措施：不同碳源、控制补料、稀释速率2) 控制原理：控制菌体的糖酵解速度，使之低

5、于TCA循环和呼吸链的最大代谢能力，从而避免乙酰辅酶 A 的积累和乙酸的产生3) 控制代价：降低蛋白质合成和菌体生长4) 怎样控制发酵过程中的乙酸量以提高菌体的生长速率?控制补糖速度补氨加酵母抽提物加甲硫酸氨改良菌株6、影响高密度发酵的因素1) 培养基基质中营养源的种类和含量比要求高碳源和氮源比例偏小，会导致菌体生长旺盛，造成菌体提前衰老自溶比例偏大，则菌体繁殖数量少，细菌代谢不平衡，不利于产物积累优化碳源、氮源以及微量元素和无机盐2) 溶氧浓度过高或过低都会影响细菌的代谢，对菌体生长和产物表达影响很大维持较高浓度，不仅有利于菌体生长，而且有利于外源蛋白的表达发酵过程中保持适宜度，必须确定发酵

6、罐的通气量和搅拌速度3) pH稳定的pH是菌体保持最佳生长状态的必要条件pH的改变会影响细胞的生长和基因产物的表达4) 温度影响细菌生长和调控细胞代谢高温利于细菌生长，提高菌体的生物量过高的温度会抑制菌体生长和外源蛋白质的表达5) 代谢副产物大肠杆菌在发酵的过程中，产生一些有害的代谢副产物: 乙酸、二氧化碳等，抑制菌体的生长和蛋白的表达降低代谢副产物积累措施：a.保持高溶氧的同时，采用流加补料的措施b.保持适当的比生长速率7、选择基因工程药物分离纯化方法的依据1) 根据产物表达形式来选择p 分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低，纯化前必须浓缩，可用沉淀和超滤法。p 可溶性表达产物破菌后的细

7、胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。p 产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化。p 为了获得周质蛋白，经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。2) 根据分离单元之间的衔接选择p 应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。p 先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。p 即通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。p 随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和

8、亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。p 层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤色谱。3) 根据分离纯化工艺的要求来选择分离纯化工艺应遵循以下原则： 具有良好的稳定性和重复性 尽可能减少组成工艺的步骤 各技术步骤间要相互适应和协调 工艺过程中尽可能少用试剂 工艺所用时间要短 工艺和技术必须收率高、易操作、能耗低 具有较高的安全性8、基因工程药物培养过程的质量控制1) 生产用细胞库基因工程产品的生产采用种子批系统。需证明种子批不含致癌因子，无细菌、病毒、霉菌和支原体等污染，由原始种子批建生产用工作细胞库。在此过

9、程中，在同一实验室工作区内，不得同时操作两种不同的细胞或菌种，一个工作人员亦不得同时操作两种不同的细胞或菌种建原始种子必须确证克隆基因 DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞/载体系统稳定性确定最高允许传种代数2) 培养过程培养过程中应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞/载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。培养周期结束时，应监测宿主细胞/载体系统的特性，如

10、质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因的载体的酶切图谱等9、单克隆抗体的不足1) 目前单克隆抗体均是鼠源性抗体，应用于人体内可产生人抗鼠抗体（human antimouse antibody, HAMA) 人体的排斥反应 人体内半衰期只有5-6小时 到达靶组织的药量仅有12) 完整的抗体分子的相对分子量较大，穿透力不强，难以到达病灶的核心部位10、HAT培养液选择培养(1)选择性培养的必要性：经细胞融合后，得到脾-脾、瘤-瘤、脾-瘤融合细胞，这些细胞的增殖速度比杂交瘤细胞更快，并很快将其淘汰，故必须选择性培养，筛选出杂交瘤细胞(2)选择性培养的原理：为获得目的细胞，需将融合后的细胞

11、立即转入选择性培养基中，常用HAT培养基,是用次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶（T）配成。氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，加之通常选择的骨髓瘤细胞为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)缺陷型，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞在培养几天后也会死亡，而杂交瘤细胞由于“功能互补”则可以存活。 、生物技术药物分为哪些类型？ 答：一般说来，采用DNA重组技术活其它生物技术研制的蛋白质或核酸类药物，可称为生物技术药物。 生物药物已经形成四大类型：一是应用重组DNA技术（包括基因工程技术、蛋白质工程技术）制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物，如基因治

12、疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等；三是来自动物、植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物。 生物药物广泛应用于医学的各领域，在疾病的治疗、预防、诊断等方面发挥着重要作用。按其功能用途可分为三类：意识治疗药物，治疗疾病是生物药物的主要功能。生物药物以其独特的生理调节作用，对许多常见病、多发病、疑难病均有很好的治疗作用，且毒副作用低。如对糖尿病、免疫缺陷病、心脑血管病、内分泌障碍及肿瘤等的治疗效果是其他药物无法替代的。二是预防药物，对许多传染性疾病来说，预防比治疗更重要。预防是控制感染性疾病传播的有效手段，常见的药物预防药物有各种疫苗、类毒素等。在疾病的预防方面只有生物可承担此任。

13、三是诊断药物，疾病的临床诊断也是生物药物重要用途之一，用于诊断的生物药物具有速度快、灵敏度高、特异性强的特点。现在已应用的有免疫诊断试剂。酶诊断试剂、单克隆抗体诊断试剂、放射性诊断药物和基因诊断药物等。 2、pBV220载体有何优点?cIts857抑制子基因及PR启动子同在一个载体上, 可以转化任何菌株, 以便选用蛋白酶活性较低的宿主菌, 使表达产物不易降解.SD序列后面紧跟多克隆位点, 便于插入带起始ATG的外源基因, 可以表达非融合蛋白.强的转录终止信号rrnB可以防止出现“通读”现象, 有利于质粒-宿主系统的稳定性.整个质粒只有3.66kb, 有利于增加拷贝数及容量, 可以插入较大片段的

14、外源基因. PR与PL启动子串联, 可以增强启动作用.3、怎样控制发酵过程中的乙酸量以提高菌体的生长速率? 控制补糖速度 补氨 加酵母抽提物 加甲硫酸氨改良菌株4、怎样提高质粒的稳定性? (1). 选择合适的宿主菌 (2). 选择合适的载体 (3). 加入抗生素 (4). 分阶段控制培养 (5). 控制培养条件 (6). 固定化5、小分子抗体有哪些优点 ？1) 分子质量小，免疫原性低。2) 易于进入实体瘤周围的微循环甚至进入实体瘤的内部。3) 无Fc片段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，用于免疫诊断时成像清晰。4) 构建较简单，易于操作和改造。5) 可在细菌中表达，易于大量生产。6) 可与多

15、种效应分子如毒素、前体药物转化酶等构建多种双功能抗体分子。6、制备McAb时为什么用HAT培养液选择培养？(1)选择性培养的必要性：经细胞融合后，得到脾-脾、瘤-瘤、脾-瘤融合细胞，这些细胞的增殖速度比杂交瘤细胞更快，并很快将其淘汰，故必须选择性培养，筛选出杂交瘤细胞(2)选择性培养的原理：为获得目的细胞，需将融合后的细胞立即转入选择性培养基中，常用HAT培养基,是用次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶（T）配成。氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，加之通常选择的骨髓瘤细胞为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶 (HGPRT)缺陷型，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞在培

16、养几天后也会死亡，而杂交瘤细胞由于“功能互补”则可以存活。7、为什么要改造鼠源性单抗？（1）McAb是鼠源性抗体，可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间 ；（2）完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。因此，需要进行改造：（1）降低McAb的免疫源性；（2）、降低McAb的相对分子质量。1、基因工程的诞生（1）理论上的三大发现确立了遗传物质是DNA, 而不是蛋白质： 提出DNA分子双螺旋的结构模型： 提出“操纵子”学说, 破译了遗传密码.（2）技术上的三大发明 DNA体外切割和连接技术.

17、基因工程载体技术. DNA分子序列分析及相关技术.2、基因工程药物生产的基本过程 基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克隆，构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等。以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将会随研究和生产条件的不同而改变。 定义：基因工程技术是指将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传

18、物质的重新组合，并使目的基因再工程菌内进行复制和表达。 基因工程药物制造的一般流程：（1）获得目的基因；（2）组建重组质粒；（3）构建基因工程菌；（4）培养工程菌；（5）产物分离纯化；（6）除菌过滤；（7）半成品检定；（8）包装3、RNAi的作用原理 RNAi (RNA interference) 即RNA干涉，是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象,是由双链RNA（dsRNA）介导的、由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。RNAi 广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物各种生物中。同时作为一项新兴生物技术，RNAi有

19、着广泛的应用前景。本文主要论述了RNAi的发现、RNAi 的机理、RNAi的作用特点以及RNAi 的应用前景。目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义： RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。 RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。

20、如果将其作为一门生物技术，则定义为： RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。 RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt23nt 的小片段，使相应的基因沉默。 RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - tr

21、anscriptional gene silence , PTGS)。各种不同定义虽然说法不同，但所描述事实是大体相同的，简单地可以说，RNAi就是指由RNA介导的基因沉默现象。4、基因工程菌在代谢控制方面与传统微生物的相同和不同点基因工程菌在代谢控制方面与传统微生物有许多相似之处，比如补料控制、pH控制、温度控制、溶氧控制等，使菌体能够达到高密度。它的特殊之处在于外源基因的稳定性、外源蛋白表达的诱导、蛋白降解的防止以及生长与表达的协调等方面，以达到高表达的目的。5、抗体药物的作用机理直接效应：a.诱导凋亡 b.抑制增殖 c.阻断生长因子或生长因子受体 d.干扰血管生成间接效应： a.依赖补体的细胞毒（CDC） b.依赖抗体的细胞毒（ADCC) c.作为毒素、放射性同位素和细胞毒药物的载体 d.形成抗独特型抗体 e.通过双特异性抗体靶向效应细胞6、抗体药物研究的趋向寻找新的分子靶标抗体人源化抗体药物的高效化抗体药物分子的小型化抗体融合蛋白