AB8型大孔吸咐树脂纯化马比木喜树碱工艺研究毕业论文

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1、 吉首大学毕业论文吉首大学2011届学士毕业论文 论文题目 AB-8型大孔吸咐树脂纯化马比木喜树碱工艺研究 学生姓名 学号 20074192017 学 院 生物资源与环境科学学院 专业年级 2007级植物科学与技术 指导教师 职称 讲 师 目 录摘 要3关键词3Abstracts3Keywords31前言32材料、仪器与试剂42.1 材料42.2仪器42.3试剂53实验部分53.1马比木喜树碱的提取53.2大孔树脂预处理53.3静态吸咐53.3.1上样液浓度的选择5.3.2上样液pH值的选择53.3.3上样温度的选择63.3.4洗脱剂的选择63.3.5洗脱剂浓度的选择63.4动态吸附实验63.

2、4.1上样流速的选择63.4.2树脂吸附量的测定63.4.3洗脱流速的确定64. 结果与讨论74.1上样液浓度对树脂吸附率影响74.2不同pH值对树脂吸附率的影响74.3温度对树脂吸附率的影响84.4洗脱剂对洗脱效果的影响84.5洗脱剂浓度对洗脱效果的影响84.6上样流速对树脂吸附的影响94.7 树脂吸附量的测定104.8洗脱流速对洗脱效果影响105结论11参考文献12致谢14AB-8型大孔吸咐树脂纯化马比木喜树碱工艺研究 ( 吉首大学生物资源与环境科学学院 湖南吉首 416000)摘 要：本文采用乙醇溶液常温浸提的方法从马比木中提取喜树碱粗品；并用AB-8大孔吸咐树脂纯化，通过对喜树碱的上样

3、液的浓度、上样pH、上样温度、洗脱剂、洗脱剂浓度的筛选，以及对上样液流速、洗脱剂流速和树脂吸咐量的研究。结果表明吸附和洗脱的最佳工艺参数为：样液质量浓度 0.300 mg/mL，最佳上样温度为 20，最佳上样pH为 4；上样流速 25 BV/H；每克树脂吸咐量为24 mg；以70乙醇为洗脱剂，洗脱液流速15 BV/H。关键词:马比木；喜树碱；大孔吸附树脂；吸咐；洗脱Macroporous Resin Adsorption for purification of Camptothecin Yang TongSupervisor :ZHAO Dong-liang (College of Biolo

4、gy and Environmental Sciences, Jishou University, Jishou Hunan, 416000)Abstracts: Camptothecine crude products were gained from Pittosporumli Nothapodytes with ethanol solution in normal temperature. AB-8 macroporous resin was chosen for purification. Through sifting the sample solution concentratio

5、n, sample pH, sample temperature, elution concentration ,and studying the flow rate for adsorption and desorption, the optimal adsorption and desorption conditions of Pittosporumli Nothapodytes Camptothecine onto AB-8 resin were determined as follows: concentration of sample solution is 0.300 mg/ml,

6、 the best sample temperature is 20, the best sample pH is 4; flow rate for adsorption 25 BV/H, the resin adsorption of per gram is 24 mg，and the optimal ethanol concentration and flow rate for the desorption of Pittosporumli Nothapodytes Camptothecine were 70% and 15 BV/H.Keywords: Pittosporumli Not

7、hapodytes，Camptothecine，macroporous，adsorption，elut1 前言 马比木Nothapodytes pittosporoides (Oliv. ) Sleum. ,为茶茱萸科假柴龙属植物，灌木或小乔木，分布于贵州、湖南、湖北、四川等地1 。喜树碱( camp tothecin, CPT)是我国特有树种喜树(Camptotheca acum inata Decne. )中所含有的喹啉类衍生物生物碱, 具有显著的抗癌活性, 目前已有4种以喜树碱为前体合成的喜树碱衍生物获得美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床治疗结肠癌、直肠癌和复发性卵巢癌2 - 3

8、。1966年Wa11等首次从喜树植物中分离出喜树碱之后，人们对喜树碱的生物和化学性质进行了大量的研究，主要是针对抗肿瘤研究领域。目前对其抗癌作用机理的研究已经取得了一定的进展。喜树碱的抗癌作用，起初的认为是喜树碱通过抑制核酸合成，导致癌细胞内DNA降解，近年来研究结果否定了这一观点，研究发现喜树碱主要是通过抑制癌细胞DNA复制酶，阻碍癌细胞的增殖。1988年又进一步发现喜树碱主要是通过阻断DNA拓扑异构酶I合成，发挥细胞毒性的独特抗癌机理4。但受喜树碱的自身毒性及其化学特性的影响，其临床应用受到一定限制。目前，人们主要是以喜树碱为母体进行化学修饰，来获得具有抗癌活性的衍生物。在美国，喜树碱一1

9、1 和TPT已经批准用于实体瘤的临床治疗。喜树碱已经成为继紫杉醇之后第二个由植物衍生的重要抗癌药物。近年来，喜树碱在农药领域的应用研究也在逐步深入。有研究发现喜树碱能造成家蝇和马尾松毛虫不育，而且对甘蔗黄螟亦有毒杀作用5。喜树碱自Wall等首次从喜树植物中分离出以来，国内外有关喜树碱提取分离和含量测定的研究已有许多报道6 -13，喜树碱的生产也一直是以喜树的种子为原料。然而近年来，许多喜树碱生产厂家却改用马比木的根提取制备喜树碱。本文以马比木根为原料，乙醇为提取剂，提取喜树碱粗提物; 采用AB-8吸附树脂纯化，探究上样液浓度、上样pH、上样温度、洗脱剂、洗脱剂浓度、上样液流速、洗脱剂流速对纯化

10、效果的影响，确定喜树脂纯化最佳工艺。2 材料、仪器与试剂2.1 材料 马比木(经张代贵老师鉴定），AB-8大孔树脂（安微三星树脂科技有限公司），pH试纸，滤纸。2.2 仪器UV-160A 紫外可见分光光度计(日本，岛津)，EB-340HW 电子天平(日本，岛津)，DP-32 真空干燥箱(日本，Yamato)，BS-220 恒温水浴锅(日本，岛津)，R-215 旋转蒸发仪(瑞士，步琪)。2.3 试剂无水乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇、浓盐酸、氢氧化钠 （以上试剂为国产分析纯）。3 实验部分3.1 马比木喜树碱的提取取干燥马比木根粉碎混匀后，过 40 目筛，取一定量粉末置于1000 ml的烧杯中用无水乙

11、醇浸泡 2-3 天后过滤，滤渣再加无水乙醇浸泡 2-3天后过滤，重复 3-4次，合并滤液，得喜树碱提取液14。将喜树碱提取液置于旋转蒸发仪浓缩，温度为 3715 。将浓缩液置于真空干燥箱内干燥至质量不再变化，得喜树碱固体粗提物。3.2 大孔树脂预处理大孔吸附树脂先用去离子水浸泡，洗清，再用无水乙醇浸泡24h，蒸馏水洗净，然后用5%HCl浸泡，蒸馏水洗至中性，再用2%NaOH溶液浸泡，用蒸馏水洗至中性，去离子水浸泡备用。3.3 静态吸咐3.3.1 上样液浓度的选择分别取0.0109 g、0.0205 g、0.0306 g、0.0403 g、0.0505 g喜树碱粗品，用1 ml甲醇助溶17，配成

12、浓度分别为0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml的喜树碱水溶液;将上述溶液分别加入到装有活化AB-8树脂5.00 g 的5 个150 ml 三角瓶中，室温静态吸附24 h，在UV-160A 型紫外分光光度计上于254 nm波长处测量上清液的吸光度，计算树脂对不同浓度的喜树碱溶液吸附率。A0A0吸附率(%) 100% A0：吸附前吸光值 A：吸附后吸光值3.3.2 上样液pH值的选择分别称取已活化的AB-8湿树脂5.00 g，加入35 ml pH值为4、5、6、7、8、9、10 的喜树碱溶液，室温下静态吸附24 h，在波长 254 nm

13、 处测量其上清液的吸光度，计算吸附率。3.3.3 上样温度的选择称取5.00 g已活化AB-8湿树脂 6 份，分别加入 40 ml喜树碱溶液，分别在15、25、25、30、35、40温度下静态吸附 24 h，在 254 nm 处测量上清液的吸光度，计算吸附率。3.3.4 洗脱剂的选择分别取 5.00 g 已吸附喜树碱的AB-8树脂4份于三角瓶中，分别加入甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇 40 ml，对其在常温下静态洗脱，每30分钟取一次上清液；测洗脱液在254 nm 处的吸光度。3.3.5 洗脱剂浓度的选择分别称取 5.00 g 已吸附了喜树碱的AB-8湿树脂8份置于150 ml 三角瓶中，分别加入浓

14、度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液 40 ml，静置 2 h，在波长 254 nm 处测定各上清液的吸光度。3.4 动态吸附实验3.4.1上样流速的选择将AB-8树脂浸没在蒸馏水中，按湿法装柱，树脂加到柱体积3/4后，再用蒸馏水反复过柱，装好的树脂柱静止放置过夜，备用。取浓度为0.3mg/ml的喜树碱溶液流经AB-8树脂柱脂柱, 流速分别控制为15BV/h、20BV/h、25BV/h、30BV/h，每10ml 收集一管流出液，测定其吸光值A。3.4.2 树脂吸附量的测定称取湿重为10 g 的AB-8树脂湿法装柱后，用蒸馏水反复过柱，装好的树脂柱静止放

15、置过夜，备用。取喜树碱浓度为 0.3 mg/ml、pH为4的上样液在20上柱。每10 ml收集一管流出液，测定其吸光值A。3.4.3洗脱流速的确定取体积分数为70%乙醇溶液洗脱饱和吸附的树脂，流速分别控制为15 BV/h、20 BV/h、25 BV/h、30 BV/h，每10 ml收集一管流出液,测定其吸光值A。4. 结果与讨论4.1 上样液浓度对树脂吸附率影响由图1 知：随着喜树碱浓度的升高，树脂吸附率先有一个上升趋势，当浓度到0.3 mg/ml 时较好，随着喜树碱浓度的继续增大，吸附率呈现下降的趋势，故选择浓度为0.3 mg/ml 的喜树碱溶液为最佳上样液。 图1 不同喜树碱浓度下的树脂吸

16、附率Fig.1 Resin adsorption rate of different camp tothecin concentration4.2 不同pH值对树脂吸附率的影响 由图2 不同pH值对树脂吸附率的影响 Fig.2 Effect of pH value of sample solution on adsorptionpercentage of RPCF onto AB-8 resin由图2 可见，上样液的pH值对吸咐率有影响， 当pH为4 时，吸附效果最好，增大pH值吸咐率下降。由于强酸性对工业生产要求严格，不利于生产，所以本文末继续探究pH小于4 的吸附情况，选择pH为4 是最佳

17、上样pH。4.3 温度对树脂吸附率的影响温度影响树脂吸附效果，结果如图3 ，当温度升高，树脂的吸附率增加，当温度为 20时吸附效果最明显，继续升高温度，吸附率下降。故 20为最佳上样温度。 图3 温度对树脂吸附率的影响Fig.3 The effect of the AB-8resin absorption from the diffreent temperature4.4 洗脱剂对洗脱效果的影响由表1可知：30分钟时甲醇为最好的洗洗脱剂，30分钟后正丁醇和乙醇洗脱效果都很好。由于正丁醇相对乙醇沸点高，价格贵，所以本文选乙醇洗脱剂。表1 洗脱剂的筛选Table 1 Election of elu

18、ant洗脱液 各时段洗脱液吸光值30 min60 min90min甲醇3.9143.9763.976乙醇3.473 3.9363.941丙酮3.7593.8533.904正丁醇3.473 4.0194.0344.5 洗脱剂浓度对洗脱效果的影响结合目标化合物极性与乙醇的特点，根据柱层析吸附与解吸附原理，实验选择不同体积分数的乙醇为洗脱剂，结果见图5 ，随着乙醇体积分数的升高，洗脱效果先有一个上升趋势，到乙醇体积分数 70% 时，随着乙醇体积分数的继续增大，洗脱效果趋向平稳。为工艺生产节约成本，故本文选用体积分数为 70% 的乙醇为最佳洗脱剂浓度。图4 乙醇体积分数对解吸咐的影响Fig.4 Eff

19、ect of ethanol concentration on desorption percentage ofRPCF fromAB-8 resin4.6 上样流速对树脂吸附的影响图5 不同上样流速与树脂吸附效果关系Fig.5 The relationship between different sample velocity and effect of resin adsorption由图5 可以看出，在一定范围内,随着上样流速的增大，泄漏提前，当上样液流速为 15 BV/H 时, 喜树碱约在 500ml 处开始泄漏，当上样液流速为 20BV/H 时，喜树碱泄漏点大约在 440 ml处，当

20、流速为 25 BV/H 和30 BV/H 时喜树碱泄漏大约在 300ml 处。随流速的增大,树脂周围的喜树碱分子过多, 使得部分喜树碱没来得及被吸附就流出来, 树脂的吸附量降低。但流速过慢不利于生产，故上样液流速确定为 20 BV/H.4.7 树脂吸附量的测定 由图6 可知：以喜树碱浓度为 0.3 mg/ml 的样液上样，流出液的吸光值在500 ml 处有渗漏，当上样液体积大概在820 ml 处吸光值不再增加，树脂吸附饱和。每克树脂的吸附量约为 24 mg。 图6 上样液体积与吸光值的关系 Fig.6 The relationship between sample liqwid valne a

21、nd absorb light value4.8 洗脱流速对洗脱效果影响由图7 可知，洗脱液的吸光值随着洗脱液体积的增加出现先平缓再下降再平缓的规律。洗脱相同质量的喜树碱，不同流速洗脱时所用的乙醇体积不同。当洗脱流速为 15BV/H 时，曲线大约在 720 ml 处开始平缓，所用的乙醇体积最少。所以以 15 BV/H 为最佳洗脱流速。 图7 不同洗脱流速与洗脱效果的关系 Fig.7 Effect of elution rate on desorption percentage of RPCF5 结论实验采用静态吸附实验和动态吸附实验，选用AB-8型大孔树脂纯化；调节喜树碱溶液的浓度为 0.3

22、mg/ml，pH值为 4 左右,在 20通过上柱动态吸附,并控制上样流速为 20 BV/H;每克树脂的吸附量为 24 mg。吸附完毕后用 70% 的乙醇以 15 BV/H 的流速洗脱,洗脱效果明显。综上所述,用AB-8型大孔树脂分离纯喜树碱,其工艺较简单、收率高、成本低,适合工业化生产。参考文献1 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志第四十六卷M . 北京:科学出版社. 1989， 49.2 GREEMERS J P,DESPAS R, FAVALL I G, et al. Topotecan. an active drug in the second-line treatment o

23、f epithelial ovarian cancer: Results of a large European phasestudy J . J Clin Oncol. 1996, 14: 3056 - 3060.3 LORENCEA,NESSLER C L. Camptothecin over four decades of surprising findings J . Phytochemistry. 2004, 65: 2735 - 2739.4 HiangYH，Herizberg R,Hecht S and Liu LF.CamPtotheein induees Protein-li

24、nked DNA breaks via mammalian DNA toPoisomeraseJ. BiolChem.1985，260:14873一14878.5 徐汉虹. 杀虫植物与植物性杀虫剂M. 北京:中国农业出版社. 2001，267.6 尹文仲,童学飞,陈科力. 不同海拔条件下竹节参中人参皂苷含量的比较 J . 北京民族学院学报:医学版. 2006, 23 (2) : 12 - 14.7 冉先德. 中华药海:上册M. 哈尔滨:哈尔滨出版社. 1993，1316.8 向极钎,杨永康,覃大吉,等. 竹节参人工栽培技术研究 J . 中药研究与信息.2005, 7 (5) : 26 - 28

25、.9 瞿万云. 家种与野生竹节人参化学组分的薄层色谱比较分析 J . 湖北民族学院学报:医学版. 2003, 20 (2) : 12 - 14.10 蔡平,邱小星,肖倬殷. 川产竹节参皂苷元的薄层光密度扫描测定 J .四川医学院学报. 1984, 15 (3) : 237.11 向其柏,欧惠英,乐美麟,等. 竹节参中人参皂甙含量分析 J . 植物资源与环境. 1992, 1 (4) : 54 - 56.12 汪忠波,敖明章. 分光光度法测定竹节参中齐墩果酸皂甙含量 J . 安徽农业科学. 2007, 35 (26) : 8094 - 8095.13 李露,程薇,杨洁. 高效液相色谱法测定竹节参

26、中多种人参皂苷含量 J . 分析测试技术与仪器. 2008, 14 (1) : 19 - 22.14 蒲尚饶,杨朗生. 马比木根中喜树碱含量的HPLC测定方法J. 安徽农业科学. 2010, 38 (6) : 2934 - 2935, 2942.15 王洋，于涛，祖元刚等.从喜树叶中碱法提取喜树碱新工艺J. 中草药. 2001，32(10):882一884.16 周文亮,孙蕴哲，唐 星. 用大孔树脂纯化柿叶总黄酮工艺考察J. 中国药剂学杂志.2008,05(9):278-279.17 谢文明，马云超. 喜树碱的分析方法及提取纯化工艺研究J. 吉林农业大学硕士论文. 2007,05.致谢本文是在

27、赵东亮讲师的悉心指导下完成的，从论文的选题、设计、撰写以及修改指正，直至论文的顺利完成，都倾注了导师大量的心血和精力。在导师的帮助和耐心指导下，使我的科研能力和知识容量得到了不断的提高，在此向赵老师表示我衷心的感激和诚挚的敬意。本论文的在所有实验工作是在资环学院实验室完成的。在这段时间里，得到了文亦夫老师、龙华老师热心帮助和指导，为论文的完成提供了便利的实验条件，在此对他们给予我的实验技术上的指导和生活上的感怀，表示由衷的感激。在此，我要感谢父母给我的学习提供了可靠的保证，感谢大学4年所有教育过我的老师们，感谢同窗对我生活上的关心和帮助。本次论文使我在理论水平和实验能力等方面受益非浅，真是学无止境啊！最后，向所有领导、老师和朋友们致以最衷心的感谢！谢谢您们！ 2011-05-2614